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2009年 04月 08日

カスパーゼがApoptosis以外の方法でウィルスを邪魔する

Bryant B, Clem RJ.
Caspase inhibitor P35 is required for the production of robust baculovirus virions in Trichoplusia ni TN-368 cells.
J Gen Virol. 2009 Mar;90(Pt 3):654-61.

 バキュロウィルスはカスパーゼインヒビターP35で、宿主細胞のアポトーシスを止めることが知られています。核多角体ウィルスAcMNPVもそのひとつで、p35を欠いた変異体が存在します。変異型のウィルスはヨトウガ(S.f.)の細胞のアポトーシスを誘導してしまうのですが、T.niの細胞の場合ではカスパーゼが発現しているにも関わらずアポトーシスしないそうです。
 変異型のウィルス感染中は液化しないことや、変異型のウィルスはウィルス産生能が低いことなどの差異があるため、著者らはウィルス感染においてカスパーゼにはアポトーシス以外の働きあると考え、それがどのような働きであるか調べました。

 ウィルス産生に影響するのか、それともウィルス感染に関連するのか調べる為、カスパーゼインヒビターであるzVAD-fmkを感染細胞に加える実験と、zVAD-fmk存在下でウィルス感染させる実験を行いました。2つの結果から、カスパーゼは変異型ウィルスのバディングウィルスの感染を減少させることが分かりました。



 宿主体内細胞間での2次感染に関連する訳ですね。こういったウィルスの感染と産生に関する知識が集まってくれば、ベクター利用の際の条件検討もぐっと楽になるのかもしれません。あと、論文中でカスパーゼの活性のコントロールとして、Sf9に5分UVを被爆させたものが使われていました。それらのほうが、変異型ウィルスを感染させたT.niのセルラインTN-368よりもはるかにカスパーゼ活性が高いようにグラフでは見えます。ウィルスのアポトーシス誘導能って元々それ程高くないのですか?元々、というのもおかしいですが・・・メーカーサイトによるとクリーンベンチ等の殺菌灯は1分の照射でほぼ全ての、2分の照射で全ての菌を死滅させられるそうです。培地がUVを吸収するといっても、5分も当ててしまったらアポトーシスの誘導どころか原形質が破壊され、酵素群が漏れ出してしまったりするのではないかと心配になりました。

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by koretoki | 2009-04-08 03:20
2009年 04月 02日

昆虫の筋細胞でロボットを作ろう

だいぶ前から知っていたはずなのに、なぜか読んでいなかった論文
Akiyama Y, Iwabuchi K, Furukawa Y, Morishima K.
Culture of insect cells contracting spontaneously; research moving toward an environmentally robust hybrid robotic system.
J Biotechnol. 2008 Jan 20;133(2):261-6.

 近年メカニカルシステムやケミカルシステムにおいても、微細化の研究が盛んに行われています。メカニカルシステムについては、磁力や圧力を用いた技術を扱うデバイスを小さくしていくことによる"top-down"アプローチと、ミオシン-アクチン分子モーターのような小さなものから構築していく"bottom-up"アプローチがありますが、前者はデバイスの外部に大きなシステムが必要でエネルギー効率も良いとは言えず、後者は技術的に困難です。著者らはその中間のアプローチとして、筋肉細胞を用いたバイオアクチュエイターの開発を行いました。

 生物組織を用いたデバイスとしては、蚕の触覚を用いた高感度ガスセンサー、カエルを用いた水泳ロボット、心筋で構成したデバイスなどが過去に報告されていますが、生きた細胞だけで機械の構成成分をなすデバイスは未だ報告されていません。また、昆虫の筋細胞をデバイスとしての利用という視点から扱ったのは著者らが初めてで、昆虫細胞を使うメリットとして、温度感受性が低く、pHの変化にも慣用で、対応できる浸透圧の幅も非常に広いなど、閉鎖系での利用にも非常に適しているのが分かります。

 著者らはカイコとキクキンウワバの背脈管を用いて実験を行いました。供試虫を表面殺菌した後解剖して、背脈管を取り出します。それをMM培地、TC-100培地、IPL-41培地、グレース培地などに静置して自発的な収縮の有無を見ました。カイコではどの培地を用いた場合にも収縮を観察することはできませんでしたが、キクキンウワバの場合には、TC-100培地(10%FBS)を用いた実験で、18日以上も収縮を確認することができました。

 1週間以上の間、全くのエネルギー補給を必要とせずに動き続けられるデバイスとして、今後の応用が期待されます。また、グルコースなどの化学エネルギーを非常に効率よく運動エネルギーに変換することが出来るので、エネルギー問題の解決に役立つことも期待されています。



 論文の中で、大きな筋肉組織を作ろうとすると血管が無いために内部の細胞が死んでしまう、ということが書いてありましたが、トンボの大きな筋肉なんかを見ていると筋肉中に気管がたくさん走っているのが分かります。in vitroで血管を再現するのはなかなかに困難でしょうが、気管であればかなり実現可能ではないかと思いました。実際に大型細胞培養装置の中には、培養器中に中空のシリコンチューブを通すことで酸素をよく溶かす技術もありますしね。
 この話を私のボスが知ったとき、トレーいっぱいのカイコを持ってきて背脈管を培地の中で動かすように私に言いました。納期を聞くと、明日までということでした。早速ベンチに実体顕微鏡を持ち込んで作業をはじめたのですが、解剖しても背脈管が全く見当たらない。どうにもならないのでベンチでの作業を諦め、有菌条件下で元気なカイコを解剖してみると確かに脈打つ透明な組織がありました。どうも背脈管が無色である上にエタノール麻酔によって容易に止まるため、見つかりにくくなっていたのです。見えないけど確かにあるのだな、と気付いても見えないものは見えませんからなかなかうまくいきません。結局空が明るくなり始めたころトレーいっぱいのカイコはほとんどいなくなり、エタノールに浅く漬けて動いているうちに培養を完了させるという荒っぽいやり方で、動かすことができました。何が言いたいかというと、この研究はきっとすごく大変だったということです。


街中のエンジンが昆虫の筋肉に切り替わったら、きっとすごく静かで呼吸の楽な世界になるんだろうな。
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by koretoki | 2009-04-02 19:23
2009年 03月 18日

Cell strainをクローニングしてウィルス生産能UP

セルラインからクローニングされたセルストレインが、元のラインよりも効率よくウィルス生産できました、というお話。

Zhang H, Zhang YA, Qin Q, Li X, Miao L, Wang Y, Qu L, Zhang A, Yang Q.
A cell strain cloned from Spodoptera exigua cell line (IOZCAS-Spex-II) highly susceptible to S. exigua nucleopolyhedrovirus infection.
In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2009 Feb 28.

 IOZCAS-Spex-IIというセルラインを16cell/mlの濃度にした上で384wellのプレートに撒き、単一細胞培養を得ました。それぞれをラインの順化培地で飼い、2月ほどかけて実験に十分使える規模のセルライン(セルストレイン)にしました。

 クローニングする前のセルラインはウィルスの感染率が50%ほどでしたが、クローニングによって90%に向上しました。また、ウィルス粒子の産生能も2.4x10^7 OBs/mLから7.1x10^7 OBs/mLに向上しました。



 セルラインを構成する細胞たちは同じ遺伝子セットを持つという意味で元々クローンですが(蚊とかだと違うけど)、そのキャラクターは統一されておらず、ウィルスに対する感受性についても細胞ごとの差があると考えられます。クローニングによってウィルス感受性の高い細胞が選抜できたということは、セルラインを構成する細胞たちのキャラクターが単一でないことを示しています。今回のように選抜した単一細胞由来のセルストレインのキャラクターの単一性はどこまで保たれるのか、というところにも非常に興味があります。また、変化していった場合に、安定的なキャラクターの構成というものがあるのか、それともそういった極値的なものが存在せず無限に変化を続けるのか、という問題に対する理解は、セルラインを再現性の高いコントロールしやすい実験材料として扱う為にも必要であると考えられます。もし、極値がなく変化し続けるのであれば、その変化が全くもって現在存在する理論で説明不可能なのか、それともカオスなどの理論によって説明できるのか、そういったことも非常に面白い課題だと思います。

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by koretoki | 2009-03-18 15:14
2009年 03月 06日

Filter Well Insertsで腱細胞を高密度に培養する

Güngörmüş C, Kolankaya D.
Characterization of type I, III and V collagens in high-density cultured tenocytes by triple-immunofluorescence technique.
Cytotechnology. 2009 Jan 20.

 近年、心筋、神経や結合組織の細胞をin vitroで産生することが再生医療と関連して行われるようになってきました。腱(tendon)の傷害の再生を目指す場合には腱細胞(tenocyte)が重要だと考えられます。腱は乾燥重量の75-90%をコラーゲンが、0,2-5%をproteoglycanが、1-2%をエラスチンが占め、残りはfibronectinで出来ています。それらの細胞外マトリクスは腱細胞によって作られます。腱細胞を培養すると、in vitroで細胞表面にコラーゲンを作って3Dのマトリクスを作ることが知られていますが、でも単層培養ではin vivoの類似環境としては不十分だと考えられています。長期培養ではコラーゲンの産生能が低下してしまうことも知られています。Millicell Filter Well Insertsは伝統的なプラスティックディッシュよりも細胞の付着を促進し、apical(頂端の、尖端の)とbasolateral(側底の、基底の)両面から培地に触れられるのでより自然な増殖環境を再現できます。著者等はFWI上で腱細胞を高密度に培養し、腱細胞内の、コラーゲンⅠ,Ⅲ,Ⅴの分布を、3重ラベル免疫蛍光染色を用いて調べました。

 まず、腱をexplant cultureに供し、migrationしてきた2極のspindle shape型の細胞形態で、丸い核を持った細胞を継代しました。4週間単層培養を行った後、FWIに植え継いで、3週間培養しました。


 1週目の終わりには細胞がaggregationし、時間の経過と共に集団同士がだんだんと合体して、3週目の終わりには1-2mmのクラスターになりました。そうやって高密度に培養された腱細胞のコラーゲン分布を調べると、Ⅰ型は核の周りに多く、Ⅲ型は細胞質に分散していました。Ⅴ型は細胞質の原線維と小胞の形成部に多く見られました。

 著者等は、FWI上での高密度培養が、腱細胞を多種コラーゲン産生能を失わせることなく培養するための適切な培養であると結論付けています。この高密度培養法はtissure engineeringや腱の再生への応用が期待されます。

 あのザル、Drosophila Mycの実験みたいに2種の細胞の相互関係を調べるためのものだとばかり思っていたのですがこんな風にも使えたんですねー




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by koretoki | 2009-03-06 23:39
2009年 03月 06日

金コロに付けて活性up

ドーピングに使われるエリスロポエチンの友だちでしょうか?

Gong J, Ito Y.
Peptide immobilized on gold particles enhances cell growth.
Cytotechnology. 2009 Jan 11.

 トロンボポイエチン(Thrombopoietin, TPO)は332個のアミノ酸残基を持つ血小板産生因子であり、巨核球系前駆細胞からの血小板の産生を誘導します。そのため血小板減少症の治療薬として注目されており、組み換えTPOなどが開発されています。また、非ペプチド性のTPO-like 活性を持つ物質も見出されています。今回著者らは、細胞系を用いた実験で、金コロイドに固定することで、14-15ペプチドのTPOミミックがより高いTPO-like 活性を持つことを示しました。
 
 組み換えヒトTPOをPolyethylene glycol修飾したものが臨床で用いられているそうですが、抗原性があってそこがネックだそうです。本研究で用いられた金コロ‐ペプチドのミミックは大丈夫だといいですね。




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by koretoki | 2009-03-06 18:07
2009年 03月 05日

融合細胞の計数と単離の楽な方法

Hu L, Plafker K, Henthorn J, Ceresa BP.
A non-invasive technique for quantifying and isolating fused cells.
Cytotechnology. 2009 Feb 28.

 細胞融合は、正常な発生において肝臓や筋肉の発生や授精で起こり、また、oncogenic virusesによって引き起こされます。したがって、細胞融合は生物学的、病理学的に重要なイベントですが、融合のプロセスや融合した細胞の運命を辿る研究手段は限られていました。著者らは、融合した細胞の計測と、融合した細胞の単離の方法を開発しました。
 融合させたい細胞に、T7プロモーターT7バクテリオファージRNAポリメラーゼか、T7プロモーターで発現誘導できる黄色蛍光蛋白(YFP)を導入します。それら2種類の細胞が、融合して両方が細胞の中で同時に存在するとき、黄色蛍光蛋白(T7-YFP)が発現します。YFP発現細胞は蛍光顕微鏡で確認でき、フローサイトメトリーを用いて計数することも、選別することもできます。単離されたYFP陽性細胞は、融合細胞の運命・増殖・変形・染色体数を見るのに役立つことが考えられます。




 著者らは過去に、oncogeneであるHPV16E5が細胞融合を引き起こすことを証明する為に、すなわち異数化か融合かを示す為に、ビデオを撮らなければならなかったそうです。フローサイトメトリーで融合細胞のみを分けて得られるところがすごくいいと思いました。

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by koretoki | 2009-03-05 13:59
2009年 03月 05日

non-invasiveに初代培養:絶滅危惧種の動物から培養を得るには

 Australian dragon lizardsは、遺伝多系解析や、温度依存性決定様式を持つことからアジア原産と考えられており、70種13科が報告されています。著者らはこれまで、血球細胞や結合組織由来の繊維芽細胞系を用いて、molecularやcytogenetic研究を行ってきました。絶滅の危惧などでトカゲを殺せなくなりましたが、トカゲの大概は小さいため、殺さずに血液や内部組織を採るのは不可能です。そこで、足や尻尾の移植片培養から繊維芽細胞系を得る方法を考えました。

Ezaz T, O'Meally D, Quinn AE, Sarre SD, Georges A, Marshall Graves JA.
A simple non-invasive protocol to establish primary cell lines from tail and toe explants for cytogenetic studies in Australian dragon lizards (Squamata: Agamidae).
Cytotechnology. 2009 Feb 6.

 実験には5種のトカゲが用いられました。まず、トカゲの足や尻尾を70%エタノールのついたガーゼで拭き、先の5-10mmを切り取って組織片を得ます。組織片を培地中で細かく切り刻み、移植片培養に供しました。遊出した細胞の指数増殖は1-5週間で、fibroblastic morphologyを示したようです。10passage以上の継代が可能で、凍結融解もできました。




 生きたままのトカゲをクリーンベンチに持ち込んでの作業は大変だったんじゃないかと想像します。


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by koretoki | 2009-03-05 11:48
2009年 03月 04日

PCDのときのCa2+はどこから?

Manaboon M, Iga M, Iwami M, Sakurai S.
Intracellular mobilization of Ca(2+) by the insect steroid hormone 20-hydroxyecdysone during programmed cell death in silkworm anterior silk glands.
J Insect Physiol. 2009 Feb;55(2):122-8.

 昆虫の変態時におこるPCD(Programed Cell Death)は、遺伝子発現カスケードでない経路で引き起こされることが知られています。著者らは今回、初代培養細胞にPCDを引き起こす条件を設定した上で、各反応に対する阻害剤を添加することで薬理学的に、PCDの経路を調べました。

 培養されたのは、カイコのsilk glandです。120時間の比較的長期な培養で実験を行っています。培養に20Eを添加すると細胞質Ca2+濃度が上昇し、PCDして細胞形態の変化やDNAの断片化が見られることがこれまでの研究で知られています。ここでは、5種類のPCD阻害剤候補物質を添加することで実験が行われました。


 まず、2つのCa2+チャンネルの阻害剤が添加され、結果PCDが阻害されたことから、Ca2+チャンネルが細胞外のCa2+を輸送することで濃度上昇が引き起こされることが示唆されました。しかし、Ca2+Freeの培地を用いた培養においても20E添加区においてPCDが誘導されることから、細胞外のCa2+の関連が否定されました。つまり、[PCDにおける細胞質のCa2+濃度上昇は、細胞内の何かが放出することに依る]と考えられます。

 そこで、次にその「何か」を調べる実験が計画されました。候補としてERが挙がり、それがIP3Rの活性化によって放出されることが知られていたため、IP3Rのアンタゴニストが添加されました。ここではDNAの断片化は阻害されました。しかし、凝集はとめられませんでした。IP3RはIP3に関連して活性化され、IP3は一般的にPLCによって活性化されるため、PLC阻害剤が添加されました。細胞の縮小は抑えられ、DNA断片化も阻害されました。PLC/IP3経路は活性型GPCRによって刺激されるため、GPCR阻害剤が添加されました。1mMの添加でDNAの断片化は阻害されませんでしたが、核の断片化は阻害されました。2mMの添加では共に阻害されました。2つの断片化が独立に、しかしGPCR依存的におきる事が分かります。



Ca2+を細胞内のリザーバーが持ってるところが面白かったです。
他の生物では分かっているのでしょうか?



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by koretoki | 2009-03-04 02:37
2009年 03月 02日

血管新生する細胞は足場の硬さを知っている

Mammoto A, Connor KM, Mammoto T, Yung CW, Huh D, Aderman CM, Mostoslavsky G, Smith LE, Ingber DE.
A mechanosensitive transcriptional mechanism that controls angiogenesis.
Nature. 2009 Feb 26;457(7233):1103-8.

血管新生は細胞間の生理学的相互作用や、VEGFのような可溶の細胞外マトリクスによってコントロールされています。しかし、機械的刺激など他の微細環境の刺激の関連については未知です。今回、Rho阻害剤であるp190RhoGAP(GRLF1)が拮抗的転写因子であるTFII-I(GFT2I),GATA2の活性のバランスを調整することで、
in vitroではヒトの微小血管内皮細胞でのネットワーク形成キャパシティを、in vivoでは網膜の血管新生をコントロールしていることが明らかになりました。さらに、血管新生シグナル系は細胞外マトリクスの弾性に感受性がありました。


弾性に関わる実験は、150Paと4000Paの2つの弾性をもつポリアクリルアミドゲルにフィブロネクチンをコートしたものを培養基材として用い、HMVEcellを培養し、調べています。著者らは、それぞれの培養におけるVEGFR2mRNAの転写量を比較しました。VEGFR2の発現はTFII-IとGAGAの支配下にあることが知られています。


細胞が足場とした物質の硬さによって振る舞いを変えることは経験的に知られていますが、変化の意味を明らかにした上で示したことが凄いと思いました。




久々の更新です。
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by koretoki | 2009-03-02 16:03
2009年 02月 13日

bystander effectの個体差

個体差は個体差でも前回のとは意味が少し違うようです。

Mothersill C, Rea D, Wright EG, Lorimore SA, Murphy D, Seymour CB, O'Malley K.
Individual variation in the production of a 'bystander signal' following irradiation of primary cultures of normal human urothelium.
Carcinogenesis. 2001 Sep;22(9):1465-71.

 Bystander effectとは、放射線を照射した細胞から非照射細胞への傷害の伝達のことです。細胞系へのα線、γ線の照射に引き続くbystander effectは議論されていません。また、この効果は、がんのリスク評価や放射線治療の計画のために重要です。

 in vivo研究の問題は、他の被爆細胞からのシグナルによってノイズが入り、研究できないところでした。著者らは、この問題を解決するため、ヒト組織の小片を体外で被爆させた後、培地に入れて、移植片や、bystander effectに安定して反応する細胞系に加える系を考えました。

 そして、患者間のシグナル発生の個人差について、分子や細胞のエンドポイントで評価しました。この研究には100人以上の患者が参加し、また、低い被爆で反応するマウスの細胞系が用いられました。


 結果、被爆移植片の培養上清が、非被爆の移植片や細胞系の細胞をbystander effectで死なせることが明らかになりました。また、異なる患者に由来する組織片は、異なるbystander effectを生みました。性差や、喫煙もこれに影響しました。


 統計はMann-Whitney U testで、"Total males versus total females"とか、"All smoker versus all non-smoker"とか、されているので、個人差というよりかは、個人群差といった感じがします。



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by koretoki | 2009-02-13 21:37