したっぱ昆虫細胞研究者のメモ

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2009年 01月 15日

カイコはsmall RNAでトランスポゾンをコントロールしてる

先日ショウジョウバエのテロメアについてのレビューを紹介しましたが、やはりトランスポゾンをコントロールする方法が存在するようです。

Kawaoka S, Hayashi N, Katsuma S, Kishino H, Kohara Y, Mita K, Shimada T.
Bombyx small RNAs: Genomic defense system against transposons in the silkworm, Bombyx mori.
Insect Biochem Mol Biol. 2008 Mar 27.

small RNAには、microRNAs(miRNAs)、small interfering RANs(siRNAs)などがあり、mRNAの分解、転写抑制、ヘテロクロマチン構成、DNA除去などの役割を担っていると考えられています。
siRNAsはRNAiに関連して有名ですが、長いdouble stranded RNA(dsRNA)をRNase Ⅲ-like enzyme Dicerが約21ntにカットすることで産生されます。
最近small RNAの3番目のクラスとしてpiwi-interacting RNAs(piRNAs)が注目されています。piRNAは26-33ntと、siRNAs(21-23nt)より長く、ArgonauteプロテインファミリーのサブクレードメンバーであるPiwiと会合する特徴があります。
ショウジョウバエのgermlineを用いた研究で、piRNAsがトランスポゾンをサイレンシングすることが分かってきました。

著者らはカイコの卵巣由来RNAsから67,700配列38,493種のsmall RNAを同定し、キャラクターを調べました。



釣ってきたsmall RNAのうち72%の27,815種がカイコゲノムのnew scaffoldと一致しました。完全一致したもののうち46%はrasiRNAにクラス分けされ、これらはゲノム中に5回以上hitするand/or ReASに少なくとも1度反復します。
rasiRNAに分類されたsmall RNAsはlong terminal repeat(LTR)、クラスⅡDNAトランスポゾン、short interspersed nuclear element(SINEs)を含む様々なトランスポゾン因子にhitしました。

SART1とTRAS1はよく解析されたテロメア特異的non-LTRレトロトランスポゾンですが、small RNAsのうちそれらと合致するものはそれぞれ131kinds(387clones),10kinds(11clones)でした。
ショウジョウバエではテロメアがHeT-A,TAHRE,TARTなどのテロメアレトロトランスポゾンによって維持されることが示されていて、かつ、RNAiベースのTARTサイレンシングが起きていることも報告されています。
カイコでも、SART1にhitするrasiRNAsがRNAiベースのテロメア維持に関わっていることが推察されます。



エキロロアンしました。
これはもうやるしかないでしょう

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by koretoki | 2009-01-15 02:52
2009年 01月 10日

イオンチャンネル型匂いレセプターの発見;ショウジョウバエ

昨年の4月に匂い受容体として7回膜貫通型タンパクについての発表がありましたが、ショウジョウバエでは匂いセンサーのニューロンのすべてが匂い受容体としてそれを発現しているわけではありません。
今回著者らは、イオンチャンネル型のグルタミン酸レセプターに関連した未知の匂い受容体を発見しました。

Richard Benton,Kirsten S.Vannice,Carolina Gomez-Diaz and Leslie B. Vosshall
Variant Ionotropic Glutamate Receptors as Chemosensory Receptors in Drosophila
Cell, Volume 136, Issue 1, 149-162, 9 January 2009
著者らはハエのアンテナで発現する遺伝子についてのバイオインフォマティックなスクリーニングから、61の遺伝子ファミリーに注目しました。
分子構造的にグルタミン酸レセプターに似ていたそうですが、よく見ると似てるけどグルタミン酸レセプターではなく、他のリガンドと引っ付くようです。
で、以下の7つの理由で、これを新しい匂いレセプターIonotropic Receptors(IRs)としたそうです。

1、IRsの15のmRNAは成虫のアンテナで特異発現。
2、匂い受容ニューロンの樹状突起でIRs抗体が光った。
3、IRを持つ匂い受容ニューロンはOr83b(7回型)を発現しない。
4、coeloconic小感覚子発達異常ミュータントはIRを発現しない。
5、ニューロンの4つのクラスターのIR発現が、4つのcoeloconic小感覚子の生理学特徴と相関する。
6、通常匂い受容を投射するニューロンは軸索に糸球体一つつくるが、Ir76a-GAL4でラベルした軸索はcoeloconicからの入力を処理するとされる一つの糸球体に収束する。
7、IRをmisexpressionさせると新しい匂い感受性が表れる。

ひとつのニューロンにひとつしか発現しない他の匂い受容体と違って、IRはひとつのニューロンにいくつも発現するそうです。
混乱しない仕組みはどうなっているのでしょうか?
グルタミン酸レセプターと同じ仕組みなら誰がbindしても陽イオン流入して反応してしまうように思うのですが・・・



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バイオインフォマティクスすげー
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by koretoki | 2009-01-10 03:55
2009年 01月 07日

ExGen 500は昆虫セルラインへの遺伝子導入においても有効

昆虫セルラインのうち、Spodoptera frugiperda由来のIPLB-SF-21-AEやそのクローンであるSf9、またTrichoplusia ni由来のHigh Fiveが、研究用もしくは商業用としてよく用いられています。

これら鱗翅目由来セルラインへの遺伝子導入方法はリン酸カルシウムをはじめ哺乳類で開発された様々な方法(参考:培養細胞への遺伝子導入法 (石川恵))や、NPVなどのvirusベクター用いる方法がありますが、いずれも毒性や導入効率などそれぞれに欠点があり、新しい方法が求められています。

今回著者らは新規遺伝子導入試薬、ポリエチレンイミン(製品名ExGen™ 500)の昆虫セルラインへの応用を検討しました。
Ogay ID, Lihoradova OA, Azimova ShS, Abdukarimov AA, Slack JM, Lynn DE.
Transfection of insect cell lines using polyethylenimine.
Cytotechnology. 2006 Jun;51(2):89-98. Epub 2006 Nov 2.

導入効率は、ExGen™ 500で導入したGFPがどれだけ光るかを、画像認識ソフトを用いて測定することで評価しています。
Sf9を用いた実験では、半数以上の細胞に導入され、9割ほどの細胞が生存しました。



やっぱり画像認識ソフトは使えるようにならないと、と思いつつ道具を見てみたら、たぶん手元にある・・・
そして、ExGen™ 500!!
これの遺伝子導入機構はかっこいいです。

コスモバイオより
e0160319_0373254.jpg

①ExGen™ 500と目的のDNAが安定で拡散性の高い複合体を形成します。
          ↓
②ExGen™ 500の“水素イオンスポンジ効果”が、大量の水素イオンの蓄積と受動的な塩化物イオンの流入を誘発し、エンドソームのpHを中和します。
          ↓
③浸透圧の膨潤がエンドソームの破裂を引き起こし、目的のDNAが核に移行します。

著者らは、イントロで
カイコ由来セルラインBMNは1種のvirusベクターしか使えないが、Sf9は5種類以上のvirusベクターが使えるから凄い。
と述べているのですが、ExGen™ 500があれば解決されるのでは?



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by koretoki | 2009-01-07 00:39
2009年 01月 04日

切り落とされた足ですら光を受容して概日リズムを刻む

忘年会シーズン、正月を経て私の生活リズムはガタガタですが、ショウジョウバエは脚だけでも正確な概日リズムを刻めるようです。

Plautz JD, Kaneko M, Hall JC, Kay SA.
Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.
Science. 1997 Nov 28;278(5343):1632-5.

著者らは、ルシフェラーゼもしくはGFPをclock遺伝子プロモーターの下部領域に組み込み、概日リズムを可視化して実験を行いました。

結果、ショウジョウバエの頭、胸、腹の組織は、切り出された後も概日リズムを刻み、触角、脚、翅でさえも概日リズムを刻むことが分かりました。
また、光を当てることによってリズムがリセットされるようです(!)。



人間では、ひざの裏で感じる光が概日リズム調整のためのクリティカルな要因になっているという話を聞いたことがありますが、目以外の細胞が光を感じているというのはなんとも不思議な話です。
培養細胞でも概日リズムはあるのでしょうか?また、もしあるとすれば、光を受容して調整する仕組みまで保存している細胞系はどれほどあるのでしょうか?
なんだか細胞に見られてるような気がしてきました(笑



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by koretoki | 2009-01-04 06:39
2008年 12月 21日

Sf-9をなだめてすかしてP450生産

P450は様々な生物に広く存在する450nmに吸光ピークをもつ酸化酵素で、結晶化させて構造解析をするために大量の生産が必要とされています。
P450を生産する際、E.coliだとN末膜アンカードメインを調整して遺伝子導入しないと発現されません。例えば、hydrophobic部をbovineCYP17A1にする、とか、2番目のコドンをアラニンに変える必要があります。

昆虫細胞バキュロウィルスベクター系を用いれば、そういう必要がないので、虫・草・人のP450生産に使われています。しかし、全てのP450を生産することはできず、P420(P450にならなかった失敗作)しかできない場合もあります。

今回著者らは、バキュベクでうまく作れるPapilio polyxenes由来のCYP6B1と、うまく作れないPapilio multicaudatus由来CYP6B33を比較し、後者の欠点を改善することで、これまでバキュベクで作りにくかった種類のP450を生産するための方法を開発しました。
Mao W, Berenbaum MR, Schuler MA.
Modifications in the N-terminus of an insect cytochrome P450 enhance production of catalytically active protein in baculovirus-Sf9 cell expression systems
Insect Biochem Mol Biol. 2008 Jan;38(1):66-75.

CYP6BのN末端40ペプチド配列間の比較から、1-20のSAD配列と32番目のペプチドに狙いをつけます。
実際CYP6B33の1-20までをCYP6B1のものに入れ替えたキメラ配列と、32をAlaにした変異体をバキュベクでSf9に導入したところ、しっかりと生産するようになりました。また、生産物の活性を評価すると、V32Aの1ペプチド変異の方が高くなる結果が得られました。
シグナルアンカーと膜リンカーの効果の相互作用も考察されています。



遺伝子工学的手法をもちいて生物や細胞を生産の場にすることは、今や一般的な手法となっていますが、試薬同士の相性など、利用の妨げになって、「それはそういうもの」として避けて通ってしまいがちなところに、生物システムの本質が隠れているように思いました。

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by koretoki | 2008-12-21 02:01
2008年 12月 18日

ロボットの鼻でコンタミ早期発見

Kreij K, Mandenius CF, Clemente JJ, Cunha AE, Monteiro SM, Carrondo MJ, Hesse F, de Los Molinas MM, Wagner R, Merten OW, Gény-Fiamma C, Leger W, Wiesinger-Mayr H, Müller D, Katinger H, Mårtensson P, Bachinger T, Mitrovics J.
On-line detection of microbial contaminations in animal cell reactor cultures using an electronic nose device.
Cytotechnology. 2005 Jun;48(1-3):41-58.

high-value biological productsを得る目的で細胞を大量に培養する際、中の状態を知るために溶存酸素濃度やpHをモニターすることが一般的でした。
しかし、コンタミネーションに関して上記の2つのモニタリングでは早期発見が不可能でありました。

今回用いられたElectronicNose(EN)は、多数の揮発性成分センサーで、バイオリアクター内の気層から培養の状況を把握する機械です。
コンタミネーションを速やかに検出できることが期待されていて、また、in-invasiveな方法でモニター出来る利点もあります。


試用には、rhM-CSFを作るためのCHO、VP2proteinを作るためのSf9の他、HEK、MLVの4つの細胞系が用意されました。

Sf9についての実験では、通常の培養、E.coli混入区、カビ混入区、バキュロウィルス導入区が用意され、ENのモニターによる培養経過の比較が行われました。

結果、E.coliはもちろん、溶存酸素濃度やpHでは見つけられないカビの混入も見つけられました(コンタミ開始後115時間かかるけど)。
バキュロウィルス導入区では、増殖中はコントロールと差異がなく、目的ペプチドが発現するようになって差異が出現しました。




モニターが出来てもコンタミを取り除く事は出来ませんが、ずっと新鮮培地を流し続けるような連続的培養であれば被害の拡大を止められそうです。
でもやっぱり除けないんだったら…
ちなみに、ENのセンサーは18種類あって、Acetic acid,Ammonium chloride,Lactate,Methionine,Acetone,Ethanolのそれぞれに3種類ずつあります。

余談ですが、大量培養の場合、メンテナンスなどの理由で金属容器が好まれます。
でもそんな光もないところに押し込められて、その上誰にも見てもらえないまま物を作り続けるなんてかわいそうだし愛が足りてないです。
そういう条件でずっと世代を重ねた細胞系は、そこに適応して可能性の少ないつまらない細胞系になっていく気がします。
もっとも、画一的細胞群の方が工学的に使いやすいのだけど。

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by koretoki | 2008-12-18 17:24
2008年 12月 15日

続・ハエのがん

ハエ(Drosophila)のがんのレビューです。
ハエのがんの研究から得られた知見が、どの程度ヒトのがんの解明や治療に役立つのか興味深いところです。

David Bilder
Epithelial polarity and proliferation control:links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors
GENES & DEVELOPMENT 2004 Aug 15;18(16):1909-25.

このレビューでは、
lethal giant larvae(lgl)、disks large(dlg)、scribble(scrib)の、ひとつのpathwayで働く3つのがん抑制遺伝子について紹介していて、大まかに3つのセクションに分かれています。

1、3つの遺伝子の機能
2、ヒトのがんとハエのがんの類似点
3、polarityとproliferationが共働する機構

前回に引き続き、今回はヒトのがんとどのくらい似てるのか、から書きます。

●ヒトのがんとハエのがんはどのくらい近いのか
ハエの1遺伝子の変異でヒトのがんと似た現象が起こる。
nTSG変異細胞はApoptosisもする。
Apoptosis耐性は過剰な増殖と関係ない。
ハエのがんもヒトのがんも異数化、多核化しない。
ハエのテロメーゼはテロメアの伸張に無関係。
ハエの3つのnTSGのうちひとつの変異で十分である。
ハエはひとつ、ほ乳類は複数の変異ががん化に必要。
それは寿命の長さの違いによるものではないか。
ハエでは、ほ乳類のようなバックアップやチェックポイントがない?
nTSG変異細胞が全てがん化するわけではない。imaginal diskだったら必ずなるけど。
増殖の遅い細胞の場合、周囲の細胞との競争によってApoptosisしたりする。(Myc関係)
nTSGの変異によるがん化は(ヒトのハエのも)独自のpathwayにを持っている。

●cancerで、脊椎動物のnTSGの役割は何か。
Scribはひとつの(hScrib)
Dlgは4つの(hDlg,Chapsyn-110,NE-Dlg,PSD-95)
Lglは2つの(Llgl1,Llgl2)
ホモログがある。
nTSGは進化的に保存されている。
ほ乳類のnTSGホモログはがん化を制御する。
がん化蛋白は、例えばp53の場合のようにがん抑制蛋白と結合し不活化する。
そのひとつの対象はPDZ蛋白である。
ヒトパピローマウィルスHPV(子宮頸がんウィルス)の場合、E6はがん抑制遺伝子であるp53と結合し分解することで発癌に寄与している。E6はそれ以外にもhTERTの再活性化やPDZドメインを持つたんぱく質を分解することで発癌に寄与している。
そして実際、HPV陽性の悪性腫瘍にはhScribの活性がない。

●ほ乳類の表皮での極性と増殖のコントロール
あんまりだから割愛



ハエでのがんの研究はそれなりにヒトのがんの研究に役立つようです。
今回nTSGの例のように進化的に保存された遺伝子であれば、バックアップもチェックポイントもない非常に単純な系で、ヒトのがん研究が出来るので有益であるようです。
実際Scribでは研究が進み、Scribの欠損がApoptosis耐性を与える事で細胞のがん化を促進するそうです。あれ?ハエのと機能違う?


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by koretoki | 2008-12-15 14:27
2008年 12月 13日

浸潤転移するハエのがん

ハエ(Drosophila)のがんのレビューです。
ハエのがんの研究から得られた知見が、どの程度ヒトのがんの解明や治療に役立つのか興味深いところです。

David Bilder
Epithelial polarity and proliferation control:links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors
GENES & DEVELOPMENT 2004 Aug 15;18(16):1909-25.

このレビューでは、
lethal giant larvae(lgl)、disks large(dlg)、scribble(scrib)の、ひとつのpathwayで働く3つのがん抑制遺伝子について紹介していて、大まかに3つのセクションに分かれています。

1、3つの遺伝子の機能
2、ヒトのがんとハエのがんの類似点
3、polarityとproliferationが共働する機構

長いので数回に分けて記述するつもりです(汁

1967年、ハエのがんは見つかった。
「細胞が急速に増殖し出血し個体を死に至らしめる変異体」であり、「振る舞いが悪質のがんに似ている」と記述されている。
その後、体細胞ハイブリッドを用いた実験によって、がん抑制遺伝子tumor-suppressor gene(TSG)が見つかった。
ヒトのがんとの類似性も議論さるが、TSGについて比較すると、ホモロジーが低いことや、細胞内の局在が異なる事が指摘されている。


●ハエのがん抑制因子
無脊椎動物のがんは一般に少ないとされるが、ハエのがんはスクリーニングによって見つかってきた。スクリーニングの性質上、がんを引き起こすものより、TSGとして見つかっている。
変異体でみつかったがんの異常増殖は、imaginal discを見ることで分析できる。
ハエのがんには大きく2つ、hyperplastic(過形成)とneoplastic(新生物)とがあり、前者は急速に増殖するものの、形は正常細胞と同じで、単層で増える。対して後者は、丸い形で単層をつくることはできない。

●neoplastic tumer-suppresser gene(nTSG)
現在3つのnTSG(lgl,dlg,scrib)が見つかっている。
これらの変異体幼虫は、3齢まで正常に発生する。
しかし、その後彼らは蛹化せず、2週間ほど死ぬまで育ち続ける。彼らの体長は伸び、体はふくれあがるため、giant larvaと呼ばれる。体内では、imaginal表皮と神経が異常に増殖している。さらには、脳もoptic lobeの過形成によって伸びている。
これら表現型の相似が、nTSGが共通のpathwayで動くことを示唆する。

●nTSGがコードする蛋白
3つのnTSG全てが、転写因子ではなく細胞質蛋白をコードしている。Dlg,Scribはともにscaffold蛋白であり、Lglの昨日は不明だが、前記の2つによって補填されるとされている。

●polarityとnTSG変異細胞について
正常な上皮細胞は、正常な細胞の形、強い接着、単層の形成、頂低極性をもっている。
変異細胞は、丸く、接着性は低く、多層を形成します。重要なのは、極性の喪失が他の形質を引き起こす最初の変化とされていること。
正常ならapical部に局在する蛋白が、変異体では細胞表面に自由に散らばっていることが、nTSGがクリティカルに細胞表面構造を調節していることを示唆している。
インテグリンによるマトリクスへの接着はハエの頂低極性には関係ないとされている。
3つのnTSGに加え5つの遺伝子が上皮の極性を決めるとされていて、8つの遺伝子は基本的に3つの蛋白複合体をコードしている。
Crombs,Par-3などがここでは取り上げられているが、nTSGと他の極性遺伝子の調整段階の分子機構は良く分かっていない。
nTSGの極性に関する機能は上皮だけに限らず、神経でも働いている。

●proliferationについて
細胞の異常増殖は細胞分裂チェックポイントが効かなくなることで引き起こされるが、ハエのimaginal diskではG1/Sレギュレータcyclin Eがそれに当たる。
実は、若い幼虫時のnTSG変異体のdiskは正常個体のそれより小さいことも知られている。孵化5日目では野生型の1/3しかない。しかし、蛹化の時期に10日以上増え続け、野生型の5倍に達する。
蛹化失敗自体は細胞増殖の原因にならず、変異体でもエクジステロイドパルスを消されると異常増殖は起きない。
変異体のdiskを野生型に移植すると異常増殖が起きて宿主を殺すが、野生型のdiskを変異体に移植しても異常増殖は起こらない。
polarityとともに、proliferationは上皮だけでなく、神経組織でも働く。
全ての分化する細胞がnTSG変異による変形を起こすわけではない。

●differentiationについて
nTSG変異体の細胞は最終的に分化能を持たない。

●invasionとmetastasis
nTSG変異細胞は浸潤の性質を見せる。
卵巣上皮のnTSG変異細胞は上皮を離れて胚盤胞に侵入する。
野生型にnTSG変異細胞を移植すると転移する。
脳はもっとも浸潤されやすい組織だが、2次転移は他の部分にも育つ。




ショウジョウバエのがんは、白血病風の血球のものしか知らなかったので、固着組織由来で、転移浸潤もするような、がんらしいがんがハエに存在すること自体が非常に面白いです。
また、imaginal diskが異常増殖し、蛹化までは正常に育つところも、変態の前後で細胞の極性を司る因子が異なることを示唆し、またそれを変態に利用している可能性もあって、興味深いです。


次は、ヒトのがんとどのくらい似てるのか、から書きます。



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by koretoki | 2008-12-13 07:44
2008年 12月 04日

生物時計のケース的存在?

生物時計は転写のフィードバックで組まれたループで出来ていると考えられています。
例えば遺伝子AとBがあって、Aが転写され始めて1時間後にAの転写産物がBの転写を促進し、Bが転写され始めて1時間後にBの転写産物がAの転写を促進するようになっていれば、ぐるぐる無限に続いて時計として機能しますよ、という話です。
それに関わる遺伝子の発現パターンの脳内の局在をコオロギで見ましたよ、という論文。

Shao QM, Bembenek J, Trang le TD, Hiragaki S, Takeda M.
Molecular structure, expression patterns, and localization of the circadian transcription modulator CYCLE in the cricket, Dianemobius nigrofasciatus.
J Insect Physiol. 2008 Feb;54(2):403-13.


ショウジョウバエの転写因子、CYCLEとCLOCKはperiodとtimelessの上流にあるとされ、periodとtimelessの転写産物であるPERとTIMは、CYCLEとCLOCKと相互作用しながら自信の転写を抑制します。
ショウジョウバエでは、PRE、TIM、CLOCKは周期的に発現し、CYCLEは一日中ずっと存在すると言われています。

著者らは、CYCLEとCLOCKの転写産物に対する抗体を調製し、4時間おきに1日6回コオロギの脳を切って免疫染色し、脳内のCYCLE及びCLOCKの局在を調べました。

結果、CYCLEは脳内の様々な箇所で、時間による差が無く存在している事が分かりました。
写真を見ると、細胞の膜の方、外側の方が染まっているように見えます。
CYCLEもCYCLEと同じように、脳内の様々な箇所で、時間による差がなく存在しています。
こっちは、核が染まっている写真がありました。



CYCLEとCLOCKがどうやって見つかったのか知りませんが、もしショウジョウバエでのKO実験から、生物時計に関連すると考えられたなら、時計のムーブメントではなく、ケースの部分のような働きの遺伝子であってもいいのかなと思いました。



おねがいします↓
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by koretoki | 2008-12-04 04:29
2008年 12月 03日

昆虫初代培養用MX培地

PubMedで「MX medium primary culture insect」を検索しても出ないと思ったら特許で見つけました。
最近PubMedの表示変わりました?

今西 重雄、羽賀 篤信、三橋 淳
昆虫細胞初代培養用培地、細胞外マトリックスおよびこれらを用いた短期間での昆虫培養細胞株作出法
特開2006-136339(P2006-136339A)

著者らは、細胞系樹立を目的とした昆虫細胞初代培養に適した培地を作りました。
また、昆虫由来の水溶性キチンで培養基材をコートし、細胞接着を促進しました。

 組成表を見て、MGM450培地とMM培地を混ぜたらいけるんじゃないかと思いました。MX培地で作出された鞘翅目の培養細胞株はありましたっけ?日本で作出された鞘翅目の培養細胞株はオオスジコガネFRI-AnCo-5B、ブドウトラカミキリXP-1、ドウガネブイブイTUAT-AnCu-35、クリストフコトラカミキリPC-1の4つで、どれもMGM450培地を用いていたと思います。キチンコートは昔、北海道の方がカニの殻から作ってましたが、そのときのディッシュは白いキチンが縦横無尽に走っており、観察には邪魔そうでした。観察しやすいキチンコートディッシュは使ってみたいです。


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by koretoki | 2008-12-03 01:47