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2017年 12月 31日

はじめまして!

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by koretoki | 2017-12-31 23:59
2013年 12月 06日

NLTKで論文を読んでみた

今日の材料はこれ
Transcriptome Responses of Insect Fat Body Cells to Tissue Culture Environment

映画「The Social Network」の脚本をNLTKで解析して遊んでみたや、
「魔法少女まどか☆マギカ」の台詞をNLTK(Natural Language Toolkit)で解析するに習ってやってみました。
途中グラフ描くのがやばかったので、Matpotlibのインストールで詰んだあたなへを参考にEPDを使って楽しました。

論文のテキストをコピーペーストし、'pc論文.txt' として保存しました。
iPythonを起動し、

#20131206追記
import nltk
from nltk.book import *

#データの読み込み
raw=o p e n ('pc論文.txt').read()
#単語認識
tokens=nltk.word_tokenize(raw)
text=nltk.Text(tokens)

#単語数
len(tokens)
Out[12]: 5791

#語彙数
tokens_1 = [w.lower() for w in tokens] #20131206修正('s/I/1/g')
len(set(tokens_1))
Out[14]: 1935

訳2000単語知ってれば論文が書ける!!

#何回'cell' って言ってるか
tokens_1.count('cell')
Out[15]: 36

tokens_1.count('cells')
Out[16]: 27

tokens_1.count('fat')
Out[17]: 81

tokens_1.count('body')
Out[18]: 70

bodies がいる予感...

#culture とprimary が含まれる文
text.concordance("culture" and "primary",lines=5)
Displaying 5 of 8 matches:
es. Cell lines are established from primary culture of tissue when a population
roliferating cells derived from the primary tissue explant undergo immortalizat
undergo immortalization [ 5 ] . In primary cultures of insect cells , it usual
ught that during the early stage of primary culture , isolated explants activat
ant are different from cells in the primary tissue. Champy ( 1913 ) proposed th

#単語の分布をみる
fdist=nltk.FreqDist(w.lower() for w in text)
fdist.plot(50,cumulative=True)

e0160319_6553397.png


よく出てくる単語の出てくるタイミングがみたくなりますね。

#単語を指定
terms=['cells','cell','transcriptome','genes','culture','intact']

#指定した単語の分布を見る
text.dispersion_plot(terms)

transcriptomeについて話してからgenesに移行するのが多いらしい
e0160319_6564779.png


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by koretoki | 2013-12-06 10:20
2013年 06月 15日

内部寄生蜂のvenom をLC-MSとRNA-seqで調べたよ

内部寄生蜂というのは、宿主の体内に住んで育つ蜂のグループのことです。
当然宿主の体内に入ってれば、宿主の免疫系から「おまえだれ?」って聞かれたりするわけで、侵入してるのがバレたらボコボコにされてしまいます。

内部寄生蜂の親は子どもが宿主の体内でボコられないようにvenom (なんか"毒"とは直訳しない雰囲気ある)を宿主の体内に打ち込んで、宿主の血球によう包囲を抑制しようとします。

キイロショウジョウバエを宿主として寄生する蜂がいて、キイロショウジョウバエはモデル生物で情報が多いので、キイロショウジョウバエ側の免疫の研究は結構されてました。でも、寄生蜂の方はほとんど情報がなかったので、今回著者らはvenom がどんなタンパク質なのかを調べました。

PLoS One. 2013 May 23;8(5):e64125. doi: 10.1371/journal.pone.0064125. Print 2013.
Integrative approach reveals composition of endoparasitoid wasp venoms.
Goecks J, Mortimer NT, Mobley JA, Bowersock GJ, Taylor J, Schlenke TA.


実験では2種類の寄生蜂、L. b. とL. h. を使いました。
RNA-seq で寄生蜂腹部で発現してる遺伝子を特定し、LC-MS で特定したvenomu 線の中身のペプチドをそこにはりつけることで、venom のタンパク質を特定しようとしています。

RNA-seq から作ったトランスクリプトデータに、mass で得たアミノ酸配列を貼付けたところ、L.b. で129のvenom 遺伝子候補、L.h. で176のvenom 遺伝子候補がそれぞれとれました。

それらの中から、雌蜂特異的に発現するもの(雄vs雌のRT-PCR比較から)、
venom 腺特異的に発現するもの(雌体vsvenom 腺のRT-PCR比較から)を絞り込むことにしました。
※他の蜂のvenomとして、Calreticulin や、Heat-shock protein 70 が知られているので、上記の方法ではそれらの遺伝子のような、他の組織で他の仕事をしているvenom 遺伝子を取りこぼすリスクがあるそうです。

ランダムに10個のvenom 遺伝子候補を選んでRT-PCRしたところ、
L.b. でもL.h. でも10個中の8個は雌特異的に発現をしていました。

L.b. ではそれら8個の遺伝子はvenom 腺以外のところでも発現していました。L.b. では、ショウジョウバエ寄生蜂Asobara japonica と同様に、venom 遺伝子が卵巣など他の組織でも発現しているのでしょう。
一方で、L.h. では8個の遺伝子はvenom 腺特異的な発現をしていました。


次に、既知のvenom 遺伝子と相同性のある遺伝子を集めて、分泌シグナルついてるやつだけを集めました。
GO解析をしたところ、L.b. のサンプルでは、antioxidant activity がエンリッチしていました。
ショウジョウバエの免疫応答では、酸素ラジカルを発生させていると考えられているので、L.b. は抗酸化タンパクをvenom として用いて、免疫に対抗していると考えられます。



RNA-seq とMASS を組み合わせた方法は、ゲノムが分かっていない生物の分泌タンパクを特定するのにすごい効くと著者らは述べています。




寄生蜂の話をするといっつもvenom っていう謎物質が出てきて苦しめられてきたのですが、蜂によって全然違うんですね。
今回の研究で見つかった200個くらいのvenom 候補をひとつづつ試してもらって、venom の成分完全同定されるようになると期待しています。
あと、いままでGO階席でぱりっと意味をとる論文に出会えてなかったので、すごい絞り込んだ遺伝子群でG0解析→エンリッチみっけ→エンリッチさせている遺伝子これな→知見と会わせてばっちり考察してるのが楽しかったです。





以下メモ

L.b., L. h. について
幼虫か蛹に産卵
L. b. は卵を免疫から隠して、血球が卵の表面にふれるのを防ぐ。宿主の免疫は寄生されていても強い。
L. h. は宿主の免疫を破壊する。

最初はcDNAをクローニングして進めた。4つとれた。でも、100くらいはありそうなので、ほんの表面だけしか見れていない。

P. puparum のmass もやったけどトランスクリプトがないから56個の予測venom のうち12個しか取れなかった。

Chelonus inanitus のESTsやった。29個みつかって、いくつかは完全にユニークな配列だった。

Microctonus hyperodae でRNA-seqやった。8個の全長venom 遺伝子見つかった。

Nasonia vitripennis でmass やってゲノムのにはっつけたら79venom 遺伝子見つかった。

→核酸+アミノ酸のアプローチがいい
→NGSでせめるのがいい



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by koretoki | 2013-06-15 10:30
2010年 11月 23日

昆虫ホルモンがカイコの後胚子発生において脂肪体の自然免疫を劇的に制御している

昆虫ホルモンによるゲノムワイドな自然免疫の制御@カイコ脂肪体

Ling Tian1†, Enen Guo2†, Yupu Diao1, Shun Zhou1, Qin Peng1, Yang Cao2, Erjun Ling1, Sheng Li1
Genome-wide regulation of innate immunity by juvenile hormone and 20-hydroxyecdysone in the Bombyx fat body
BMC Genomics 2010, 11:549

昆虫の自然免疫はJHと20Eに影響されうる。しかし、いかに自然免疫が2つのホルモンによって発生上制御されているかは解明されていない。カイコにおいては、最終脱皮(4M)の間にJHと20Eは高いレベルになり、5齢摂食時(5F)にはなくなる。一方蛹期では、JHは低く20Eは高いレベルになる。脂肪体はホルモン応答分子を生産し、ゆえに脂肪体は自然免疫に関与する主な器官とみなされてきた。

4M、5F、PPのカイコ脂肪体のゲノムワイドマイクロアレイ分析は多数の発現量の違う遺伝子を明らかにした。特に、4MではPPと比して、6つの抗菌ペプチド(AMP)が上方制御されている。このことは、カイコの自然免疫が発生上2つのホルモンによって制御されていることを示唆している。第一に、JH処理は劇的にAMP mRNAレベルと活性を増加させる。さらに、20E処理はAMP mRNAレベルと活性への阻害効果を示し、また、20Eレセプター EcR-USPをRNAiしたところ20E処理と逆の効果を示した。

カイコの後胚子発生における脂肪体では、JHは免疫活性剤として働き、20Eは自然免疫を阻害していた。

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by koretoki | 2010-11-23 02:09
2010年 05月 17日

こっちのみーずはあーまいぞー

degenerin/epithelial (Deg/ENaC) sodium channel familyであるPPK28が、水に対する細胞と行動の反応を仲介している。
Peter Cameron, Makoto Hiroi, John Ngai & Kristin Scott
The molecular basis for water taste in Drosophila
Nature 465, 91–95 (06 May 2010) doi:10.1038/nature09011

候補遺伝子は、味覚ニューロンをマイクロアレイして探索しました。哺乳動物の味覚システムではイオンチャンネルはすっぱさと塩味を検知していることから、著者らは、味覚リッチなイオンチャンネルを候補と考え解析を進めました。その中で挙がった遺伝子PKK28は、プロモータと推定される遺伝子で、口吻で発現していました。PKK28-Gal4のニューロンに様々な濃度のNaCl、Sucrose、Ribose、NMDG、PEG溶液を与え、G-CaMP系でニューロンの発火を検知したところ、いずれの溶液においても低濃度で発火しました。pkk28をノックアウトしたハエはスクロースに反応しましたが、水には反応できませんでした。苦味に反応する味覚ニューロンにpkk28を発現させると水に反応するようになりました。また、HEK293細胞にpkk28を発現させると低張液に反応するようになったそうです。

これらのことからPKK28を水の知覚に関連していると結論付けました。



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by koretoki | 2010-05-17 15:07
2010年 05月 15日

培地データベース

Brunner D, Frank J, Appl H, Schöffl H, Pfaller W, Gstraunthaler G.
Serum-free cell culture: the serum-free media interactive online database.
ALTEX. 2010;27(1):53-62.

http://www.goodcellculture.com/

FBSを使わない培養にはいろいろメリットがあるけど、細胞にあったFBSフリーの培地を探すのは手間なもの。interactive online databaseつくって情報交換しようよ、っていうことらしいです。この論文自体は培養とは何か、とか、FBSの役割、とか易しい総説風です。後輩にあげよう。

さっそくgoodcellcultureでぐぐってみたものの、topしか表示されない・・・
IEでやり直し。Gchromeでは駄目でした。

現時点で登録されている昆虫細胞用の培地は以下の16です。

BD BaculoGold Max-XP, BIOINSECT-1, CELLect Insect Cell Culture Medium, CELLect Serum-free Insect Virus, Chemically Defined Lipid Concentrate, Drosophila-SFM, Express Five SFM, HyClone SFX-Insec Cell Culture, Insect Express Prime, Insect Medium Supplement, IS BAC Medium for Insect Cells, Serum Free, Met Free Insect Culture Medium, Serum-Free Insect Culture Medium, Serum-free Insect Medium-1 Protein-free, Sf-900 II SFM, Sf-900 III SFM

初代培養をやるときの培地選びって、前例がなければ端から順番にやるしかない。そういうときに近い動物での成功例が分かったらとても助かると思います。




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by koretoki | 2010-05-15 05:11
2009年 09月 04日

同じc-DNAから組み換えCYPを作っても、昆虫細胞とヒト細胞の場合でkineticsが違ってくる

研究したい蛋白質のc-DNAから、微生物や細胞系を利用して組み換え蛋白を得ることは広く行われていますが、研究対象が酵素の場合は注意なようです。
Christensen H, Mathiesen L, Postvoll LW, Winther B, Molden E.
Different enzyme kinetics of midazolam in recombinant CYP3A4 microsomes from human and insect sources.
Drug Metab Pharmacokinet. 2009;24(3):261-8.

 ヒトCYP3A4はヒトの肝臓と腸で最も多いCYPで、治療薬などの分解に寄与していることで知られています。この研究ではCYP3A4が催眠鎮静薬であるミダゾラムを分解する酵素kineticsについて注目し、ヒト細胞と昆虫の細胞でそれぞれ発現させたミクロソーム内組み換えCYP3A4を比較しました。著者らはそれぞれのCYP3A4を基質であるミダゾラムと反応させて、主生成物である1'-hydroxymidazolam(1'-OH MDZ)と副生成物である4-hydroxymidazolam(4-OH MDZ)の量をLC-MSで測定し、Km値(ミカエリスメンテン定数?)とVmaxを求めました。結果、1'-OH MDZを生成する際に、ヒト細胞由来recCYP3A4は典型的なミカエリスメンテンkineticsを示し、一方で昆虫細胞由来recCYP3A4は基質阻害kineticsを示しました。総じてヒト細胞由来recCYP3A4は昆虫細胞由来に比べて高いKm値を示し、このことはvivoの状況と関連するので重要だと述べています。



 組み換え蛋白発現で酵素を作る場合に、異なる補助因子の影響が注目されてきていて、例えば、電子供与蛋白であるcytochrome b5はc-DNA発現させたCYP酵素活性に影響を与える重要な因子として同定されているそうです。もちろん著者らはcytochrome b5にも配慮して実験を行っています(昆虫細胞区ではwith and without coexpressed cytochrome b5の2つが設定されていたり)。HoustonとKenworthyの仮説に"異なるrecombinant sourceでは酵素の活性部位が違う"というのもあるそうです。異種昆虫間でも同じことが起こるのでしょうか?ハエの酵素をSf9に作らせたら違った、とか、錦秋鐘和のを大造由来セルラインに作らせたら違った、とか・・・

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by koretoki | 2009-09-04 03:15
2009年 08月 27日

免疫細胞に選択的に感染するrecバキュロウィルスベクター

Martyn JC, Cardin AJ, Wines BD, Cendron A, Li S, Mackenzie J, Powell M, Gowans EJ.
Surface display of IgG Fc on baculovirus vectors enhances binding to antigen-presenting cells and cell lines expressing Fc receptors.
Arch Virol. 2009;154(7):1129-38. Epub 2009 Jun 26.

 バキュロウィルスは哺乳動物細胞に対して細胞傷害を示さない為、ベクターとして広く利用されています。組み換えバキュロウィルス(以下recBV)を用いて肝炎ウィルスの蛋白をマウスの細胞に導入すると、抗体の産生と、細胞仲介性の免疫反応を示すことがわかっています。
 そして、バキュロウィルスの表面に任意の蛋白を提示させることで、提示された蛋白と結合するモノを表面に持った細胞に選択的に感染させる方法も研究されてきました。今回著者等は、Bリンパ球やマクロファージの細胞膜上にあって、抗原提示や貪食の過程を仲介するIgG Fc受容体を狙うため、表面にIgG Fcを提示するrecBVを作りました。


 著者らは2つのカセットを持った組み換えバキュロウィルス(recBV)を設計開発しました。昆虫細胞に感染させるとIgG Fcを発現し、哺乳類細胞に感染させるとhepatitis C virusの構造蛋白を発現します。IgG Fcは昆虫細胞内において、シグナル配列と、膜貫通部位(バキュロウィルスのエンベロープ蛋白であるgp64、もしくはヒトトランスフェリン受容体)との融合蛋白として発現し、typeⅠもしくはtypeⅡ複合膜蛋白となります。いずれの場合も、IgG Fcは細胞膜上に配置される蛋白の組み換え型として発現し、細胞膜の表面にくるようになります。どちらのrecBVも、水に溶いたFcγRⅡα受容体とセルラインとFc受容体を発現する抗原提示細胞に特異的に結合しました。Fc受容体を発現する免疫細胞を標的とするこれらの新しいバキュロベクターは、ワクチン産生と遺伝子治療への利用の可能性を持っています。



ウィルスの表面に何かを提示させて、それに相対する何かを持った細胞を狙うっていうコンセプトがとてもcool!免疫細胞を狙ったのも面白いです。こういう話大好きです。


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by koretoki | 2009-08-27 23:50
2009年 08月 20日

百聞は一見にしかず

情報技術によって動画のやり取りが容易になり、我々も頻繁に動画でデータを取るようになりました。でも、動画のジャーナルがあるとは知りませんでした。

Journal of Visualized Experiments

まるでNHKの教育番組
下の論文ではDrosophilaのグリア細胞が移動する様子が撮影されています。

Cafferty P, Xie X, Browne K, Auld VJ.
Live imaging of glial cell migration in the Drosophila eye imaginal disc.
J Vis Exp. 2009 Jul 9;(29). pii: 1155. doi: 10.3791/1155.

IntroでAuthorが登場するのが面白いです。
そしてMat & Methがもの凄く分かりやすいです。



無料トライアルで見ましたが、課金してしまおうかと悩んでます。

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by koretoki | 2009-08-20 22:59
2009年 06月 17日

インフルエンザワクチンを昆虫セルラインで作ると

インフルエンザワクチンってまだ鶏卵で作ってるのかと思ってたら、そんなことなかったんですね。

June 12, 2009 07:15 CET
Novartis successfully demonstrates capabilities of cell-based technology for production of A(H1N1) vaccine


なんの細胞使ってるのかは知りませんが、ヘンリエッタさんの細胞の絞り汁とかだったらちょっと体に入れたくないですね・・・
宗教の理由で輸血を拒否される方は、ヒト細胞由来のワクチンはどうするんでしょう?
昆虫由来だったら・・・

Manon M.J. Cox and Jason R. Hollister
FluBlok, a next generation influenza vaccine manufactured in insect cells
Biologicals Volume 37, Issue 3, June 2009, Pages 182-189

著者等は、ヨトウガ由来細胞系SF+を用いてインフルエンザワクチンを作成する方法について安全性や効果を検討しました。

FluBlokという3価の血液凝集素ワクチン(rHA)はバキュロウィルス発現系を用いて作るワクチンであり、現在鶏卵を用いて作られている3価の不活性型インフルエンザワクチン(TIV)に対してアドバンテージを持つ可能性があります。高い安全性や、迅速なワクチン生産が期待されています。

まず、レトロウィルスが入ってないか調べました。IdUとか熱ショックとかかけて、ウィルス粒子が出てこないか電顕で調べました。結果、出てこなかったので→レトロウィルスがSF+に入ってないのが分かりました。
また、PCRで既知の昆虫ウィルスが入ってないかも調べました。

それから、治験を行いました。


rHAはTIVの3倍の凝集素を含み、オボアルブミンをはじめとした卵の蛋白や保存剤を含みません。また、純度の高い抗原は副作用の少ない多量投与を容易にするとも著者等は述べています。




以前に化学メーカーさんから、ウィルスフリーのセルラインない?って問い合わせがあったんですが、ワクチン作りたかったのかな?
治験は18歳以上の3000人の方の協力を得て行ったそうです。
謝礼を3万ちょい払うといちおくえん・・・
18才以下の子どもの治験って誰が意思決定するんでしょう?

そういえば先のノバルティスのワクチン、MF59®っていう加速装置みたいのを積んでるようです。
痛くて怖い予防接種もこういうこと考えながら行けばワクワクして楽しく受けられそうですね

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by koretoki | 2009-06-17 06:47