したっぱ昆虫細胞研究者のメモ

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2008年 12月 20日

箱根の人面魚の肝臓もばっちり培養!!!

鯉の肝臓細胞初代培養法についての論文。
おさかな培養についてちょっと詳しくなれます。

魚類細胞系は毒性評価などに使われ、現在150ほどあります。
室温で飼えること、浸透圧に強いことが特徴として挙げられます。
また、L-15培地を用いる場合にはCO2インキュベータも要りません。

将来的に工学利用の面で、昆虫細胞のライバルになるかも知れませんね。

著者らは今回、コイの肝細胞初代培養の条件検討を行いました。
Yanhong F, Chenghua H, Guofang L, Haibin Z.
Optimization of the isolation and cultivation of Cyprinus carpio primary hepatocytes
Cytotechnology. 2008 Oct 18.

解剖して得た肝臓をバラバラにする方法として、機械的分離、コラーゲナーゼによる分離、パンクレアチンによる分離を試験しました。
また、培地はDMEM,M199,L-15をテストし、17℃,27℃,37℃の3段階の温度で培養しました。

培養状況のモニターはMTT法を用いて行いました。
以下MTT法解説(コスモバイオHPより転載)
>MTT〔3-(4, 5-Dimethyl thial-2-yl)-2, 5-Diphenyltetrazalium Bromide〕は淡黄色の基質で、生細胞のミトコンドリアにより開裂し(死細胞では開裂しない)、晴青色のホルマザン(Formazan)を生成します。このホルマザンの生成量は生細胞数と相関しています。

結果、パンクレアチン、L-15培地、27℃が最適条件であるとされました。




最近Cytotechnology誌がPubMedに引っかかるようになってうれしいです。
今回の論文は、種々の物質のアッセイに用いるための実験系開発のお話でした。
最近初代培養はもっぱら生理活性物質アッセイのために用いられることが多いようですが、初代培養自体が由来組織のアッセイに用いられることも多く、私はそっちの方が読んで楽しいです。
例えば昭和30年代日本で行われた研究では、脳腫瘍の初代培養からの細胞遊出の頻度が、腫瘍の悪性傾向と正相関するとか、なんかもう腫瘍細胞が愛らしくなってくるくらいたまらんですvvv

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by koretoki | 2008-12-20 02:25
2008年 12月 18日

ロボットの鼻でコンタミ早期発見

Kreij K, Mandenius CF, Clemente JJ, Cunha AE, Monteiro SM, Carrondo MJ, Hesse F, de Los Molinas MM, Wagner R, Merten OW, Gény-Fiamma C, Leger W, Wiesinger-Mayr H, Müller D, Katinger H, Mårtensson P, Bachinger T, Mitrovics J.
On-line detection of microbial contaminations in animal cell reactor cultures using an electronic nose device.
Cytotechnology. 2005 Jun;48(1-3):41-58.

high-value biological productsを得る目的で細胞を大量に培養する際、中の状態を知るために溶存酸素濃度やpHをモニターすることが一般的でした。
しかし、コンタミネーションに関して上記の2つのモニタリングでは早期発見が不可能でありました。

今回用いられたElectronicNose(EN)は、多数の揮発性成分センサーで、バイオリアクター内の気層から培養の状況を把握する機械です。
コンタミネーションを速やかに検出できることが期待されていて、また、in-invasiveな方法でモニター出来る利点もあります。


試用には、rhM-CSFを作るためのCHO、VP2proteinを作るためのSf9の他、HEK、MLVの4つの細胞系が用意されました。

Sf9についての実験では、通常の培養、E.coli混入区、カビ混入区、バキュロウィルス導入区が用意され、ENのモニターによる培養経過の比較が行われました。

結果、E.coliはもちろん、溶存酸素濃度やpHでは見つけられないカビの混入も見つけられました(コンタミ開始後115時間かかるけど)。
バキュロウィルス導入区では、増殖中はコントロールと差異がなく、目的ペプチドが発現するようになって差異が出現しました。




モニターが出来てもコンタミを取り除く事は出来ませんが、ずっと新鮮培地を流し続けるような連続的培養であれば被害の拡大を止められそうです。
でもやっぱり除けないんだったら…
ちなみに、ENのセンサーは18種類あって、Acetic acid,Ammonium chloride,Lactate,Methionine,Acetone,Ethanolのそれぞれに3種類ずつあります。

余談ですが、大量培養の場合、メンテナンスなどの理由で金属容器が好まれます。
でもそんな光もないところに押し込められて、その上誰にも見てもらえないまま物を作り続けるなんてかわいそうだし愛が足りてないです。
そういう条件でずっと世代を重ねた細胞系は、そこに適応して可能性の少ないつまらない細胞系になっていく気がします。
もっとも、画一的細胞群の方が工学的に使いやすいのだけど。

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by koretoki | 2008-12-18 17:24
2008年 12月 10日

足場がないと自殺もできません

Scribbleは細胞の足場蛋白の遺伝子です。
これを失うことで細胞のアポトーシスが抑制され、がん化を促進することが分かりました。

Zhan L, Rosenberg A, Bergami KC, Yu M, Xuan Z, Jaffe AB, Allred C, Muthuswamy SK.
Deregulation of Scribble Promotes Mammary Tumorigenesis and Reveals a Role for Cell Polarity in Carcinoma
Cell. 2008 Nov 28;135(5):865-78.

著者らは、非がん性の表皮系細胞系であるMCF-10Aを用いて実験をおこないました。
ScribbleをRNAiでノックアウトすることでアポトーシスのマーカーである活性型Caspase-3がなくなりました。
また、がん遺伝子であるE7を導入したMCF-10A細胞でも同じことが確かめられたため、Scribbleががん遺伝子と共同でがん化を引き起こしているのではないか、と著者らは述べています。

さらに、移植すると2次肺(2次胚ではない)をつくる細胞系COMMA-1Dβgeo(CD)細胞系を用いた実験では、ScrbbleのRNAiによるノックアウトによって、気管の空間がほとんどなくなり、がん化することも示されました。

形成異常によるアポトーシスの減少と、過形成によってがん化が起こるのではないかと考察しています。



がん化していないとされる細胞系は、形成異常なしに過形成した細胞群と捉えていいのでしょうか?
そうするとSf-9なんかは、完全に無極性ですし、がん化している?
また、コントロール群のMCF-10A細胞で、写真に写っている総ての細胞が活性型Caspase-3を持っているのが、とても不思議でした。(Fig.1B)

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by koretoki | 2008-12-10 18:37
2008年 12月 08日

溶液中の細胞を観察できる走査電子顕微鏡

http://www.aist.go.jp/aist_j/press_release/pr2008/pr20081208/pr20081208.html
産業総合研究所が、溶液中の細胞を観察できる走査電子顕微鏡を開発したことを発表しました。

従来の電子顕微鏡は、固定し脱水した資料でないと見ることが出来ませんでした。
固定する必要があるので、1サンプルで変化を見ることはできませんでした。
脱水は非常に面倒な処理であり、ほぼ1日かかります。

今回の発明によって、細胞を生きたまま電子顕微鏡で見れるようになりました。
この技術は従来の操作型電子顕微鏡とあまり変わらない機械で実現可能なため、コストも従来型よりそう高くならないことが期待できます。
数年で普及しそうですね。

感動しました!!
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by koretoki | 2008-12-08 22:35
2008年 12月 03日

昆虫初代培養用MX培地

PubMedで「MX medium primary culture insect」を検索しても出ないと思ったら特許で見つけました。
最近PubMedの表示変わりました?

今西 重雄、羽賀 篤信、三橋 淳
昆虫細胞初代培養用培地、細胞外マトリックスおよびこれらを用いた短期間での昆虫培養細胞株作出法
特開2006-136339(P2006-136339A)

著者らは、細胞系樹立を目的とした昆虫細胞初代培養に適した培地を作りました。
また、昆虫由来の水溶性キチンで培養基材をコートし、細胞接着を促進しました。

 組成表を見て、MGM450培地とMM培地を混ぜたらいけるんじゃないかと思いました。MX培地で作出された鞘翅目の培養細胞株はありましたっけ?日本で作出された鞘翅目の培養細胞株はオオスジコガネFRI-AnCo-5B、ブドウトラカミキリXP-1、ドウガネブイブイTUAT-AnCu-35、クリストフコトラカミキリPC-1の4つで、どれもMGM450培地を用いていたと思います。キチンコートは昔、北海道の方がカニの殻から作ってましたが、そのときのディッシュは白いキチンが縦横無尽に走っており、観察には邪魔そうでした。観察しやすいキチンコートディッシュは使ってみたいです。


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by koretoki | 2008-12-03 01:47
2008年 11月 27日

免疫による自傷<マルピーギ管の場合>

昆虫の自然(innate)免疫は、体液性の免疫、メラニン化、細胞性免疫で構成されています。
液性免疫であるフェノールオキシダーゼがもたらす自傷を避けるため、周辺の組織表面をメラニン化して守る働きが観察されますが、著者らは、これが組織を障害すると考えました。

Ben M.Sadd and Michael T.Siva-Jothy
Self-harm caused by an insect's innate immunity
Proc.R.Soc.B(2006)273,2571-2574

実験にはチャイロコメノゴミムシダマシtenebrio molitorが用いられました。isofemale lineの中から、体重が0,10-0,11gの個体のみを選んで使いました。
e0160319_12171216.jpg

まずは、免疫反応によるメラニン化を、他個体から移植したマルピーギ管で観察しました。
免疫反応はナイロンファイバーで誘導しました。
図のように、ナイロンファイバーの近くに移植されたマルピーギ管の方が、激しくメラニン化されました。ナイロンファイバーを挿入されていない個体に移植したマルピーギ管はメラニン化されませんでした。
e0160319_12172431.jpg

つぎに、ナイロンファイバーを挿入した個体のマルピーギ管と、ナイロンファイバーを挿入するのに十分な穴を開けた(NF入れない)個体のマルピーギ管の運動を比べました。
マルピーギ管のアッセイには、図にしめした'oil drop'テクニックが用いられました。
実験はnatural oilの中で行います。
マルピーギ管の一端は生理食塩水に浸たし、もう一端を浸さないようにします。
すると、マルピーギ管の蠕動運動によって一端から生理食塩水がマルピーギ管の中を通り、矢印の方向に反対の端に運ばれます。
そうして出来た油の中の生食の雫の量をを、画像処理によって測り、その大きさをマルピーギ管の元気さの指標としました。
結果、ナイロンファイバーを挿入した群は、挿入しない群より有意に元気がなくなりました。
グラフを見ると大体2/3くらいになっています。



a modified 'oil drop' techniqueかっこいいです

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by koretoki | 2008-11-27 12:20
2008年 11月 26日

抗生物質はいきなり使うものじゃない

昆虫が体内に分泌する抗生物質は、侵入する微生物を殲滅するというよりかは、血球が食べた後に体内に残ってる微生物を抑えるためでした。
Eleanor R. Haine,Yannick Moret,Michael T. Siva-Jothy,Jens Rolff
Antimicrobial Defense and Persistent Infection in Insects
Science 21 November 2008:Vol. 322. no. 5905, pp. 1257 - 1259

日本語abstがついてたので貼り↓
 昆虫が地球上に存在するようになって4億年間、昆虫の持つ強力な抗菌性免疫防御機構に対して、細菌が抵抗性を進化させて、昆虫が死滅したことはほとんどない。今回われわれは、感染後の細菌排除が極めて速やかにおこり、かつ誘導性の抗菌活性が上昇し始めるのは、大部分(99.5%)の細菌が駆逐された後のみであることを発見した。われわれの実験により、昆虫の恒常的な免疫応答を受けて生き残った細菌は、その後に抵抗性が高まることが判明した。これらの結果から、誘導された抗菌物質は細菌感染の解消に働くのではなく、おもに昆虫の体内に持続的に存在する細菌から昆虫を守るために機能していることが示唆される。これらの発見は、自然界においてどのように抗菌ペプチドが用いられているかを理解することで、薬剤抵抗性のリスクを回避する治療戦略が明らかになる可能性を示している。



昆虫が微生物の侵入を受けた時、いつもONになってる「血球やフェノールオキシダーゼを用いた防御」と、侵入を受けて誘導される「抗生ペプチド分泌による防御」の2つの反応が起こります。
後者の誘導性の反応は、被侵入後1-3時間経って誘導されます。その後12-48時間後にピークを迎え、1週間以上残ります。
免疫反応には、多くのコストがかかるため、このような長期に渡る反応には、適応的な意義があると考えられてきました。
しかし、最近、ショウジョウバエで、同じ微生物2度目の侵入の際に、抗生ペプチドよりも血球が多く働いていることがわかりました。
一方で、著者らは、長期に渡る抗生ペプチドの働きが、血球に耐性を持った微生物を仕上げるためだ、と提唱してきました。

これらの前提に立って、3つの予想を立てました。
1:微生物のほとんどは抗生ペプチドが誘導される前に殺される。
2:いくらかの微生物は血球から逃れて生き残る。
3:そうして生き残った微生物は寄主の免疫に高い耐性を持つ。

確かめるために実験をしました。
実験には甲虫のTenebrio molitor雌成虫とStaphylococcus molitorを使いました。

まず、虫に注入した多量の菌の生存率を調べました。
結果、菌の99,5%が最初の30分で死にました。
次に、菌を注入した虫の血液を取り、そこから細胞を取り除いたものの、殺菌活性を調べました。
結果、1時間後から活性が出始め、1日ほどでピークを迎えました。7日目から下がり始めましたが、28日目でもピークの1/5ほどの活性を保っていました。
これで仮説1が説明されました。


続いて仮説3の説明です。
著者らは「虫に注入して生き残った菌」と「虫に注入してない菌」を、感染の経験のない虫に注入し、菌の生存率を調べました。
結果、「注入して生き残った菌」が有意に多く生き残りました。


こうして、抗生ペプチドが血球の食べ残しの微生物を抑えるために産生されている、という考えが示されました。

特に説得力があったのは、抗生ペプチドについて「次の侵入に対する予防、という説明では最低2回の侵入が必要である。しかし、食べ残しを抑える、という説明なら、1回の侵入で十分である。」とした節です。


カブトムシのディフェンシンだったらこれで説明が付く気がしますが、モンシロのピエリシンはどうなんでしょうね??
今回は、微生物に関する話でしたが、昆虫の防御は寄生蜂にもベクトルが向いてると思います。
それも含めてきりっと説明できたらかっこいいですね


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by koretoki | 2008-11-26 13:54
2008年 11月 25日

JH単独で細胞増殖阻害をする場合

ノシメマダラメイガ成虫盤由来細胞系、IAL-PID2を使った論文3報目。

H.Oberlander,C.E.Leach,E.Shaaya
Juvenile hormone and juvenile hormone mimics inhibit proliferation in a lepidopteran imaginal disc cell line
Journal of Insect Physiology 46(2000)259-265

著者らは、JHとJH類似物を培養細胞に与え、細胞増殖が邪魔されるのを観察しました。
JH1,JH3,methoprene,fenoxycarb,linoleic acid(control)が10,50,100ug/mlの力価で添加されました。
JHを培地に溶かすことは難しいので、一度アセトンに溶かしたサンプルを、脂肪酸フリーのアルブミンに吸着させ、それを培地に溶かす方法を取りました。

結果、JH1の場合、50ug/ml以上の時、増殖阻害が起こりました。JH3では、100ug/mlの時だけ増殖阻害が起こりました。
Methopreneでは100ug/mlの時だけしか増殖阻害が起きない一方、Fenoxycarbでは50ug/ml以上で増殖阻害が起きました。
Methopreneの方がFenoxycarbよりも、JHに似た構造なのに、Fenoxycarbの方が低濃度で効いたのは面白いところです。

また、論文の増殖曲線はNijhoutの提唱する、「JHの効果はpresence or absenceが重要で、血中濃度に比例しない」という考えに適合しています。

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by koretoki | 2008-11-25 12:53
2008年 11月 20日

ポリドナvirで甲虫細胞系に遺伝子導入

寄生蜂が寄主に寄生するためには、寄主の免疫系を制御する必要があります。
その因子として、venomやpolydnavirusが知られています。
polydnavirusを遺伝子導入のベクターとして用いたお話です。

D.Gundersen-Rindal,D.E.Lynn,and E.M.Dougherty
TRANSFORMATION OF LEPIDOPTERAN AND COLEOPTELAN INSECT CELL LINES BY GLYPTAPANTELES INDIENSIS POLYDNAVIRUS DNA
In Vitro Cell.Dev.Biol-Animal 35:111-114,February 1999

著者らは、gypsy mothの寄生蜂であるGlyptapanteles属の蜂のpolydnavirusを用いました。
実験には、Glyptaの寄主であるgypsy moth胚由来2つ、gypsy moth幼虫脂肪体由来1つ、Ti.ni.(Lepidoptera)胚由来1つ、Sp.fr.(lepi)蛹卵巣由来1つ、Pl.in.(lepi)翅成虫盤由来1つ、He.vi.(lepi)精巣由来1つ、Di.un.(Coleoptera)胚由来1つ、Tr.co.(Hymenoptera)胚由来2つ、Ae.al.(Diptera)卵由来1つ、計11の細胞系が用いられました。

それぞれの培養に対し、寄生蜂Glypta indiensisのメスの2つの卵巣と毒腺を添加し、観察、PCRによる遺伝子導入の確認を行いました。


結果、寄主を含む全てのLepidoptera由来細胞系とColeoptera由来の細胞系でpolydnavirusによる遺伝子導入が確認されました。
また、細胞系の由来組織の違いによる導入の可否はありませんでした。

細胞の形態や、増殖能はvirus添加後1週間は顕著であり、1-2ヶ月も経つとほとんど分からなくなってしまいました。
大体100回継代くらいまでは導入されたvirusの存在が確認され、特に長いものだと300回継代後でも確認されました。



lepiを狙った寄生蜂の持つpolydnavirusが、全く関係なさそうなcoleoの細胞に導入される―それなのに、HymeとDiではダメだというのがとても面白かったです。


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by koretoki | 2008-11-20 20:07
2008年 11月 17日

Eカドヘリンが幹細胞のpluripotencyを制御する場合

ES細胞を始めとする幹細胞の分化全能性に、culture growth factor environmentとcell-cell interactionがクリティカルな役割を果たしていました、という論文。

Chou YF, Chen HH, Eijpe M, Yabuuchi A, Chenoweth JG, Tesar P, Lu J, McKay RD, Geijsen N.
The Growth Factor Environment Defines Distinct Pluripotent Ground States in Novel Blastocyst-Derived Stem Cell
Cell. 2008 Oct 31;135(3):449-61.

ES細胞は陥入前のblastocystのInnerCellMassからつくります。
陥入後のblastocystからつくる幹細胞は、EpiS細胞です。
マウスのEpiS細胞はマウスのES細胞よりヒトのES細胞に似ています。
これらの関係から、著者らは細胞のpluripotencyが、決まったものではなく、環境によるところが大きいと考えました。

著者らは、ES細胞をつくるときのと同じICMに3種のgrowth factor(GF)を作用させ、新規のblastocyst由来幹細胞を樹立しました。
3つのGFの名前、bFGF、Activin、BIOからFAB-S細胞と名づけました。
マウスのES細胞が立体的なコロニーをつくるのに対し、FAB-S細胞は単層のコロニーをつくりました。
また、FAB-S細胞は維持のためにLIF、Bmp4といったGFや血清を必要としませんでした。

遺伝子発現を他の幹細胞と比べると、pluripotencyに関連する遺伝子(Oct4,Nanog,Sox2)は共通でしたが、FAB-S細胞には胚細胞の分化に関わる遺伝子(Stella,Blimp1,Daziなど)がありませんでした。
さらに、FAB-S細胞はtelatomaをつくる事が出来ませんでした。
telatomaをつくれないとpluripotencyは認められません。

しかし、FAB-S細胞に2つのGF(LIF,Bmp4)を加えたことろ、telatomaをつくり、またキメラマウスを作出することも出来るようになりました。
その後、LIFとBmp4抜きの培養を行っても、FAB-S細胞はtelatoma、キメラ共につくりました。

著者らは"partial pluripotency"と書かれていますが、GFによってpluripotencyが獲得されるところがすごく面白いと思います。


次に、ふつうのFAB-Sと、GFによってpluripotencyを得たFAB-Sとの比較が行われました。
結果、前者でEカドヘリンの発現が低いのに対し、後者は高い発現が見られました。
実際にふつうのFAB-SにEカドヘリンを過剰発現させるとpluripotencyが備わったので、EカドヘリンがFAB-Sのpluripotencyを制御していることがわかりました。


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by koretoki | 2008-11-17 14:43