したっぱ昆虫細胞研究者のメモ

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2009年 03月 02日

血管新生する細胞は足場の硬さを知っている

Mammoto A, Connor KM, Mammoto T, Yung CW, Huh D, Aderman CM, Mostoslavsky G, Smith LE, Ingber DE.
A mechanosensitive transcriptional mechanism that controls angiogenesis.
Nature. 2009 Feb 26;457(7233):1103-8.

血管新生は細胞間の生理学的相互作用や、VEGFのような可溶の細胞外マトリクスによってコントロールされています。しかし、機械的刺激など他の微細環境の刺激の関連については未知です。今回、Rho阻害剤であるp190RhoGAP(GRLF1)が拮抗的転写因子であるTFII-I(GFT2I),GATA2の活性のバランスを調整することで、
in vitroではヒトの微小血管内皮細胞でのネットワーク形成キャパシティを、in vivoでは網膜の血管新生をコントロールしていることが明らかになりました。さらに、血管新生シグナル系は細胞外マトリクスの弾性に感受性がありました。


弾性に関わる実験は、150Paと4000Paの2つの弾性をもつポリアクリルアミドゲルにフィブロネクチンをコートしたものを培養基材として用い、HMVEcellを培養し、調べています。著者らは、それぞれの培養におけるVEGFR2mRNAの転写量を比較しました。VEGFR2の発現はTFII-IとGAGAの支配下にあることが知られています。


細胞が足場とした物質の硬さによって振る舞いを変えることは経験的に知られていますが、変化の意味を明らかにした上で示したことが凄いと思いました。




久々の更新です。
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by koretoki | 2009-03-02 16:03
2009年 02月 13日

bystander effectの個体差

個体差は個体差でも前回のとは意味が少し違うようです。

Mothersill C, Rea D, Wright EG, Lorimore SA, Murphy D, Seymour CB, O'Malley K.
Individual variation in the production of a 'bystander signal' following irradiation of primary cultures of normal human urothelium.
Carcinogenesis. 2001 Sep;22(9):1465-71.

 Bystander effectとは、放射線を照射した細胞から非照射細胞への傷害の伝達のことです。細胞系へのα線、γ線の照射に引き続くbystander effectは議論されていません。また、この効果は、がんのリスク評価や放射線治療の計画のために重要です。

 in vivo研究の問題は、他の被爆細胞からのシグナルによってノイズが入り、研究できないところでした。著者らは、この問題を解決するため、ヒト組織の小片を体外で被爆させた後、培地に入れて、移植片や、bystander effectに安定して反応する細胞系に加える系を考えました。

 そして、患者間のシグナル発生の個人差について、分子や細胞のエンドポイントで評価しました。この研究には100人以上の患者が参加し、また、低い被爆で反応するマウスの細胞系が用いられました。


 結果、被爆移植片の培養上清が、非被爆の移植片や細胞系の細胞をbystander effectで死なせることが明らかになりました。また、異なる患者に由来する組織片は、異なるbystander effectを生みました。性差や、喫煙もこれに影響しました。


 統計はMann-Whitney U testで、"Total males versus total females"とか、"All smoker versus all non-smoker"とか、されているので、個人差というよりかは、個人群差といった感じがします。



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by koretoki | 2009-02-13 21:37
2009年 02月 12日

初代培養に現れる移植片由来個体の個体差

Drobna Z, Waters SB, Walton FS, LeCluyse EL, Thomas DJ, Styblo M.
Interindividual variation in the metabolism of arsenic in cultured primary human hepatocytes.
Toxicol Appl Pharmacol. 2004 Dec 1;201(2):166-77.

著者らは、iAs(無機砒素)の代謝の許容量の個体差(Interindividual variation)を調べるために、8人の患者から3つずつ初代培養を作りました。
そして、培地に添加されたiAsそのものの培養中の濃度変化と、iAs分解酵素であるcyt19のmRNAをrealtime RT-PCRでモニターしました。
得られた数値をLinear regressionを用いて解析し、個体差について言及しました。

結果、
iAsの代謝のパターンと程度のvariationはinterindividual variationに基くものであることを示しました。
また、それらの代謝の許容量の差異は、慢性的なiAs暴露の健康被害の感受性の個体差にも直接的な関係があるだろうと述べています。



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by koretoki | 2009-02-12 22:50
2009年 02月 04日

鰓のセルラインで水質調査

マス由来の鰓のセルラインとして、例えば、RTgill-W1が樹立されています。
類上皮の形態をとり、タイトな単層を形成します。
浸透圧の上下に強く、水質調査に向くほか、2種のvirusと1種の病原性アメーバの宿主になり得るため、病害の研究にも使えます。

Lee LE, Dayeh VR, Schirmer K, Bols NC.
Applications and potential uses of fish gill cell lines: examples with RTgill-W1.
In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2009 Jan 28.

浸透圧に関して、培養の写真を見る限りでは、HyperよりもHypoに強いようです。
昆虫細胞はHyperな方に強いので、魚は逆?のようです。

著者らは、RTgill-W1の最も大きな利点として「調べたい水を直に培養に入れられるところだ」と述べています。



魚のセルラインって美味しいんでしょうか?
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by koretoki | 2009-02-04 18:18
2009年 01月 29日

2001年Lynnの「cell lineの作り方」

IN VITRO CELLUAR & DEELOPMENTAL BIOLOGY animal vol.37 No.6 JUNE 2001

十年近く前のものですが、たまたま手に取ったらメンバーが凄かったのでメモ。
1報目は、いっつも名前が出てくるLynn!
Dwigt E.Lynn
Novel techniques to establish new insect cell lines

Graceが1962年に蛾から最初のcell lineを作ってから2001年までに500を超えるinvertebrateのcell lineが作出されてきました。
8割をLepidopteraとDipteraが占めています。
由来組織は、
卵巣:最初のcell lineは卵巣由来。Lepiで一般的。
胚:最も一般的で、cell lineの半分は胚由来。
血球:細胞を手に入れやすいが、増えにくい。
成虫盤:発生学上重要。細胞種が不明。
脂肪体:生理学上重要。肝臓に近い。病原の標的。
中腸:病害と防除に重要。
新生幼虫:胚より発生が進んでいるが、細胞種不明。
その他:クチクラ、神経、内分泌系、筋肉などは病害、防除、生理に重要で研究されているが、cell lineは稀。
一般的なcell lineの作り方は、
(1)70%エタノールで滅菌
(2)滅菌水で洗う
(3)培地に入れる
(4)組織を切り出して新しい培地に入れる
(5)30min-2h血球などを除くため放置
(6)35mmディッシュに培養したい組織片を移す
(7)パラフィルムで封をして、インキュベート
(8)24h-48hで1ml培地足す
(9)7-10dごとに0,5ml培地足す
(10)2,5mlに達したら、(9)を足す、でなく交換に切り替える。
(11)90%くらいのコンフルエントになったら1:2で継代。(※1をprimaryに残し2をsubにする)
最初はantibiotics入りの培地を使うけど、徐々に抜いてくそうです。
そうやって作った培養の組織ごとの特性は、
胚:遊出すくないけど、たまに当たる。エタ滅菌の前に塩素系滅菌も出来る。様々なステージの胚を試すべき。
卵巣:脂肪体の混入を避けるのがポイント。幼虫、蛹、成虫を試す。
血球:脚を切ったりして手に入れるのが容易。メラニン化が脅威なので、阻害剤を入れるか、脱皮の時期でPO活性の下がっている個体を用いるとよい。
新生幼虫:卵の時期に滅菌しておいて、ディッシュの中で孵化し次第切る。メラニン化対策は血球を参考に。
成虫盤:培養に適しているが、小さいのが難点。
脂肪体:様々な細胞が遊出してくる。色々な令や種を試すべき。
中腸:培養難しい。ロエブ式。

他のテクニック
増えてきた細胞の中から特定のタイプの細胞だけを抜き出して、粒のそろってcell lineに。
フィーダー細胞の利用。
低温処理で継代を楽に。



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by koretoki | 2009-01-29 18:01
2009年 01月 18日

コロラドハムシ卵由来セルラインは神経由来だった

卵由来のセルラインの場合、どこの組織由来の細胞なのか分からない、という欠点がありますが、それは同時にexplantしにくい、あるいは培養しにくい組織由来のセルラインを樹立できる可能性を秘めています。
今回は、そんな卵由来セルラインのキャラクタリゼーションから、神経由来の細胞であることが推察された話を紹介します。

1996年当時、世界には400の昆虫セルラインが存在し、そのうち鞘翅目由来のものは3つで、また、神経に由来するものは1つもありませんでした。
著者らはジャガイモの害虫であるcolorado potato beetleの卵から、IPLB-CPB2を樹立しました。

Sheppard CA, Lynn DE.
Immunoreactivities for calcium signaling components and neural-like properties of a Colorado potato beetle cell line.
Arch Insect Biochem Physiol. 1996;33(3-4):197-209.

著者らは以下のそれぞれについて抗体を作成し、CPB2にかけて、CPB2がどれも持っていることを示しました。
1、neurofilaments:神経細胞または前駆細胞で見られる細胞骨格
2、type1 inositol trisphosphate receptor:ハエではアンテナとretinaで見られる
3、SERCA2:ポンプ
4、ryanodine receptor:ハエでは胚の筋肉、成虫のventral ganglion、脳表面で見られる

2-4はすべてカルシウムシグナリングに関わるチャンネル、ポンプです。

さらに著者らは、細胞表面の電位をはかりました。
そして、ライトを当てると、電位が変化することを示しました。

保持する細胞骨格、チャンネルタンパクが神経細胞のものであるので、このセルラインは神経由来であると推察されます。
また、活動電位を生じることや光受容体を持つこともその推察の説得力を高めています。
昆虫の場合、光受容体は神経細胞のみで発現するとされています。




神経細胞は農薬のターゲットであるため、コロラドハムシのような農業害虫の神経由来セルラインはスクリーニングに役立ったのだと思います。
また、これらの特性がいつまで維持されるのか、非常に興味のあるところです。

やっぱり細胞に見られてるんだ・・・

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by koretoki | 2009-01-18 14:58
2009年 01月 15日

同じセルラインを違う培地で長期間飼うとどうなるのか

Lynn DE.
Lepidopteran cell lines after long-term culture in alternative media: comparison of growth rates and baculovirus replication.
In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2006 May-Jun;42(5-6):149-52.

用いられたセルラインは3つ。(由来組織、樹立培地)
IPLB-LdFB(gypsy moth fat body,Goodwin's IPL-52B,76(3:1))
IPLB-LdEIta(gypsy moth embryos,上に同じ)
UFL-AG-286(velvethean caterpillar embryos,Grace's medium)

用いられた培地は2つ。
TC-100 (containing 9% fetal bovine serum)
Ex-cell 400 (serum free serum)

3つのセルラインはTC-100で12年、Ex-cell 400で3年(LdFB),12年(LdEIta),1.5年(AG-286)飼われています。
まずはそれぞれのセルラインのそれぞれの培地でのgrowthが測定されました。
結果、
LdFBではどちらの培地でも同程度の増殖、
LdEItaではTC-100で高い増殖、
AG-286ではEx-cell 400で高い増殖が得られました。

次にウィルス感受性が調べられました。
結果、
LdFBではEx-cell 400の方がよく感染しました。
LdEItaでは用いたウィルスの両方でTC-100でよく感染しました。
AG-286では用いたウィルスの片方では差がなく、もう一方ではTC-100でよく感染しました。

さらに、ウィルスの生産性が調べられました。
いずれの培養でも差が少なく、唯一AG-286を用いた実験の片方のウィルスでTC-100の方がsignificantに高い生産性を示しました。

著者は、細胞の高い増殖が得られる培地が、必ずしもウィルス生産にも適した培地とは限らない、と述べています。


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by koretoki | 2009-01-15 03:24
2009年 01月 08日

ラッテ骨髄細胞に対するGFとECMの作用の相互関係

細胞がいる微細環境は、主に、液性のgrowt factorと細胞外マトリクスの2つの要素で構成されています。
著者らは、2種類のgrowth factorと1種類の細胞外マトリクスの、骨髄より分離される幹細胞(BMSCs)に対する
効果を定量的に調べました。

Geng T, Sun H, Luo F, Qi N.
Quantitative analysis of the responses of murine bone marrow mesenchymal stem cells to EGF, PDGF-BB and fibronectin by factorial design methodology.
Cytotechnology. 2008 Oct;58(2):93-101. Epub 2008 Oct 21.

細胞はラッテの骨髄より分離したBMSCを
growth factorにはEGFとPDGF-BBを
細胞外マトリクスはfibronectinを用いました。

まず、BMSCが骨形成細胞と脂肪細胞に分化しうることが確かめられ、次に、3種の微細環境構成因子がBMSCの増殖に与える影響を調べました。

結果、EGFとPDGF-BBは単独で増殖を促進しましたが、fibronectinは単独で影響を与えませんでした。
EGFとPDGF-BBを合わせて用いると、拮抗作用しました。
これは、同じレセプターをターゲットにするためと説明されています。
また、growth factorとfibronectinを合わせて用いた場合、用いるgrowth factorがEGFの場合には効果が落ち、PDGF-BBの場合には効果が上がりました。
ここが非常に面白いと感じました。

EGF,PDGF-BB,fibronectinの3つを用いて培養した場合に、細胞の大きさが小さくなり、より細長い形態を示しました。
このデータのために著者らは画像認識ソフトを用いていますが、解析に使われる画像は培養の中から"typical fields"を主観で選択しています。
現行の顕微鏡では培養全体を1度に捉えることは出来ず、解析に用いる視野を決める必要があるのが画像認識ソフトを用いた解析の欠点であると思います。
これが改善されて培養の全体を解析できるようになれば、私も是非使いたいです。



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by koretoki | 2009-01-08 23:44
2009年 01月 07日

ExGen 500は昆虫セルラインへの遺伝子導入においても有効

昆虫セルラインのうち、Spodoptera frugiperda由来のIPLB-SF-21-AEやそのクローンであるSf9、またTrichoplusia ni由来のHigh Fiveが、研究用もしくは商業用としてよく用いられています。

これら鱗翅目由来セルラインへの遺伝子導入方法はリン酸カルシウムをはじめ哺乳類で開発された様々な方法(参考:培養細胞への遺伝子導入法 (石川恵))や、NPVなどのvirusベクター用いる方法がありますが、いずれも毒性や導入効率などそれぞれに欠点があり、新しい方法が求められています。

今回著者らは新規遺伝子導入試薬、ポリエチレンイミン(製品名ExGen™ 500)の昆虫セルラインへの応用を検討しました。
Ogay ID, Lihoradova OA, Azimova ShS, Abdukarimov AA, Slack JM, Lynn DE.
Transfection of insect cell lines using polyethylenimine.
Cytotechnology. 2006 Jun;51(2):89-98. Epub 2006 Nov 2.

導入効率は、ExGen™ 500で導入したGFPがどれだけ光るかを、画像認識ソフトを用いて測定することで評価しています。
Sf9を用いた実験では、半数以上の細胞に導入され、9割ほどの細胞が生存しました。



やっぱり画像認識ソフトは使えるようにならないと、と思いつつ道具を見てみたら、たぶん手元にある・・・
そして、ExGen™ 500!!
これの遺伝子導入機構はかっこいいです。

コスモバイオより
e0160319_0373254.jpg

①ExGen™ 500と目的のDNAが安定で拡散性の高い複合体を形成します。
          ↓
②ExGen™ 500の“水素イオンスポンジ効果”が、大量の水素イオンの蓄積と受動的な塩化物イオンの流入を誘発し、エンドソームのpHを中和します。
          ↓
③浸透圧の膨潤がエンドソームの破裂を引き起こし、目的のDNAが核に移行します。

著者らは、イントロで
カイコ由来セルラインBMNは1種のvirusベクターしか使えないが、Sf9は5種類以上のvirusベクターが使えるから凄い。
と述べているのですが、ExGen™ 500があれば解決されるのでは?



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by koretoki | 2009-01-07 00:39
2008年 12月 21日

Sf-9をなだめてすかしてP450生産

P450は様々な生物に広く存在する450nmに吸光ピークをもつ酸化酵素で、結晶化させて構造解析をするために大量の生産が必要とされています。
P450を生産する際、E.coliだとN末膜アンカードメインを調整して遺伝子導入しないと発現されません。例えば、hydrophobic部をbovineCYP17A1にする、とか、2番目のコドンをアラニンに変える必要があります。

昆虫細胞バキュロウィルスベクター系を用いれば、そういう必要がないので、虫・草・人のP450生産に使われています。しかし、全てのP450を生産することはできず、P420(P450にならなかった失敗作)しかできない場合もあります。

今回著者らは、バキュベクでうまく作れるPapilio polyxenes由来のCYP6B1と、うまく作れないPapilio multicaudatus由来CYP6B33を比較し、後者の欠点を改善することで、これまでバキュベクで作りにくかった種類のP450を生産するための方法を開発しました。
Mao W, Berenbaum MR, Schuler MA.
Modifications in the N-terminus of an insect cytochrome P450 enhance production of catalytically active protein in baculovirus-Sf9 cell expression systems
Insect Biochem Mol Biol. 2008 Jan;38(1):66-75.

CYP6BのN末端40ペプチド配列間の比較から、1-20のSAD配列と32番目のペプチドに狙いをつけます。
実際CYP6B33の1-20までをCYP6B1のものに入れ替えたキメラ配列と、32をAlaにした変異体をバキュベクでSf9に導入したところ、しっかりと生産するようになりました。また、生産物の活性を評価すると、V32Aの1ペプチド変異の方が高くなる結果が得られました。
シグナルアンカーと膜リンカーの効果の相互作用も考察されています。



遺伝子工学的手法をもちいて生物や細胞を生産の場にすることは、今や一般的な手法となっていますが、試薬同士の相性など、利用の妨げになって、「それはそういうもの」として避けて通ってしまいがちなところに、生物システムの本質が隠れているように思いました。

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by koretoki | 2008-12-21 02:01