2009年 01月 04日

切り落とされた足ですら光を受容して概日リズムを刻む

忘年会シーズン、正月を経て私の生活リズムはガタガタですが、ショウジョウバエは脚だけでも正確な概日リズムを刻めるようです。

Plautz JD, Kaneko M, Hall JC, Kay SA.
Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.
Science. 1997 Nov 28;278(5343):1632-5.

著者らは、ルシフェラーゼもしくはGFPをclock遺伝子プロモーターの下部領域に組み込み、概日リズムを可視化して実験を行いました。

結果、ショウジョウバエの頭、胸、腹の組織は、切り出された後も概日リズムを刻み、触角、脚、翅でさえも概日リズムを刻むことが分かりました。
また、光を当てることによってリズムがリセットされるようです(!)。



人間では、ひざの裏で感じる光が概日リズム調整のためのクリティカルな要因になっているという話を聞いたことがありますが、目以外の細胞が光を感じているというのはなんとも不思議な話です。
培養細胞でも概日リズムはあるのでしょうか?また、もしあるとすれば、光を受容して調整する仕組みまで保存している細胞系はどれほどあるのでしょうか?
なんだか細胞に見られてるような気がしてきました(笑



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# by koretoki | 2009-01-04 06:39
2008年 12月 25日

狙った相同組み換え:イネ

正直よく分からないのですが
組み換え体とかほとんど意味が分からないのですが
相手が植物なのだからとあきらめて読みました。

■■■間違ってたら教えて下さい■■■

Yasuyo Johzuka-Hisatomi,Rie Terada and Shigeru lida
Efficient transfer of base changes from a vector to the rice genome by homologous recombination:involvement of heteroduplex formation and mismatch correction
Nucleic Acid Research,2008,1-9

例えば生物が酵素Aを発現しているが、代わりに酵素Bを発現してほしい時
酵素Aのコード領域をそっくりそのまま酵素Bのものに変えられたら素晴らしいと思います。
さまざまな非ペプチド性高分子の生産に役立つでしょう。

そして、上記のような「そっくりそのまま入れ替える」ような遺伝子組み換えのことをHomologous Recombination(HR)というそうです。
この技術は、単細胞生物や線虫で利用可能であったそうですが、植物では困難であるそうです。

e0160319_23591892.jpg

今回紹介する論文は、植物(イネ)でのHRに成功しています。
HRでは導入したい遺伝子の両端に対象となる遺伝子座の周囲と相同な塩基配列をつけることで、相同組み換えによる遺伝子のゲノムへの導入を狙います。
(上図参照)
1番上が、宿主植物の対象遺伝子座
2番目が、デザインしたT-DNA(含、導入遺伝子、ここではhpt)
3番目が、うまくいって組み変わった宿主植物の対象遺伝子座である。
相同組み換えが狙いなのだから、両端の相同配列部は一緒のものが良い。



私は勝手に思い込んでいたために、この論文のabstがしばらく理解できませんでした。
この論文のすごいのは
Base changes within the homologous segments in the vector could be efficiently transferred into the corresponding genomic sequences
という発見です。
相同部に"誤った"塩基が入ってHeteroduplexになった方がよいということです。
実際この論文では21個の点で塩基の間違いを導入しています。
斜め読みで間違ってたら申し訳ないのですが、Mismatch Correction、塩基配列の校閲機構がこの現象の原因となっているそうです。



単細胞の組み換え生物が世代を経るごとに組み替え遺伝子の頻度が下がる恐れがあるのに対し、接木で増やせる組み換え植物には圧倒的なアドバンテージがあるように思います。
たとえば、お茶をして、香気成分の代わりに医薬を作らせることができるようになれば、工場建設技術を持たない地域でも、薬をお茶から摂れるようになります。
たとえば、ジャスモン酸の代わりに、黄体ホルモンを葉に蓄積させるお茶が出来れば、人口問題の解決に確実に貢献できるはずです。

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# by koretoki | 2008-12-25 23:55
2008年 12月 21日

Sf-9をなだめてすかしてP450生産

P450は様々な生物に広く存在する450nmに吸光ピークをもつ酸化酵素で、結晶化させて構造解析をするために大量の生産が必要とされています。
P450を生産する際、E.coliだとN末膜アンカードメインを調整して遺伝子導入しないと発現されません。例えば、hydrophobic部をbovineCYP17A1にする、とか、2番目のコドンをアラニンに変える必要があります。

昆虫細胞バキュロウィルスベクター系を用いれば、そういう必要がないので、虫・草・人のP450生産に使われています。しかし、全てのP450を生産することはできず、P420(P450にならなかった失敗作)しかできない場合もあります。

今回著者らは、バキュベクでうまく作れるPapilio polyxenes由来のCYP6B1と、うまく作れないPapilio multicaudatus由来CYP6B33を比較し、後者の欠点を改善することで、これまでバキュベクで作りにくかった種類のP450を生産するための方法を開発しました。
Mao W, Berenbaum MR, Schuler MA.
Modifications in the N-terminus of an insect cytochrome P450 enhance production of catalytically active protein in baculovirus-Sf9 cell expression systems
Insect Biochem Mol Biol. 2008 Jan;38(1):66-75.

CYP6BのN末端40ペプチド配列間の比較から、1-20のSAD配列と32番目のペプチドに狙いをつけます。
実際CYP6B33の1-20までをCYP6B1のものに入れ替えたキメラ配列と、32をAlaにした変異体をバキュベクでSf9に導入したところ、しっかりと生産するようになりました。また、生産物の活性を評価すると、V32Aの1ペプチド変異の方が高くなる結果が得られました。
シグナルアンカーと膜リンカーの効果の相互作用も考察されています。



遺伝子工学的手法をもちいて生物や細胞を生産の場にすることは、今や一般的な手法となっていますが、試薬同士の相性など、利用の妨げになって、「それはそういうもの」として避けて通ってしまいがちなところに、生物システムの本質が隠れているように思いました。

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# by koretoki | 2008-12-21 02:01
2008年 12月 20日

箱根の人面魚の肝臓もばっちり培養!!!

鯉の肝臓細胞初代培養法についての論文。
おさかな培養についてちょっと詳しくなれます。

魚類細胞系は毒性評価などに使われ、現在150ほどあります。
室温で飼えること、浸透圧に強いことが特徴として挙げられます。
また、L-15培地を用いる場合にはCO2インキュベータも要りません。

将来的に工学利用の面で、昆虫細胞のライバルになるかも知れませんね。

著者らは今回、コイの肝細胞初代培養の条件検討を行いました。
Yanhong F, Chenghua H, Guofang L, Haibin Z.
Optimization of the isolation and cultivation of Cyprinus carpio primary hepatocytes
Cytotechnology. 2008 Oct 18.

解剖して得た肝臓をバラバラにする方法として、機械的分離、コラーゲナーゼによる分離、パンクレアチンによる分離を試験しました。
また、培地はDMEM,M199,L-15をテストし、17℃,27℃,37℃の3段階の温度で培養しました。

培養状況のモニターはMTT法を用いて行いました。
以下MTT法解説(コスモバイオHPより転載)
>MTT〔3-(4, 5-Dimethyl thial-2-yl)-2, 5-Diphenyltetrazalium Bromide〕は淡黄色の基質で、生細胞のミトコンドリアにより開裂し(死細胞では開裂しない)、晴青色のホルマザン(Formazan)を生成します。このホルマザンの生成量は生細胞数と相関しています。

結果、パンクレアチン、L-15培地、27℃が最適条件であるとされました。




最近Cytotechnology誌がPubMedに引っかかるようになってうれしいです。
今回の論文は、種々の物質のアッセイに用いるための実験系開発のお話でした。
最近初代培養はもっぱら生理活性物質アッセイのために用いられることが多いようですが、初代培養自体が由来組織のアッセイに用いられることも多く、私はそっちの方が読んで楽しいです。
例えば昭和30年代日本で行われた研究では、脳腫瘍の初代培養からの細胞遊出の頻度が、腫瘍の悪性傾向と正相関するとか、なんかもう腫瘍細胞が愛らしくなってくるくらいたまらんですvvv

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# by koretoki | 2008-12-20 02:25
2008年 12月 18日

ロボットの鼻でコンタミ早期発見

Kreij K, Mandenius CF, Clemente JJ, Cunha AE, Monteiro SM, Carrondo MJ, Hesse F, de Los Molinas MM, Wagner R, Merten OW, Gény-Fiamma C, Leger W, Wiesinger-Mayr H, Müller D, Katinger H, Mårtensson P, Bachinger T, Mitrovics J.
On-line detection of microbial contaminations in animal cell reactor cultures using an electronic nose device.
Cytotechnology. 2005 Jun;48(1-3):41-58.

high-value biological productsを得る目的で細胞を大量に培養する際、中の状態を知るために溶存酸素濃度やpHをモニターすることが一般的でした。
しかし、コンタミネーションに関して上記の2つのモニタリングでは早期発見が不可能でありました。

今回用いられたElectronicNose(EN)は、多数の揮発性成分センサーで、バイオリアクター内の気層から培養の状況を把握する機械です。
コンタミネーションを速やかに検出できることが期待されていて、また、in-invasiveな方法でモニター出来る利点もあります。


試用には、rhM-CSFを作るためのCHO、VP2proteinを作るためのSf9の他、HEK、MLVの4つの細胞系が用意されました。

Sf9についての実験では、通常の培養、E.coli混入区、カビ混入区、バキュロウィルス導入区が用意され、ENのモニターによる培養経過の比較が行われました。

結果、E.coliはもちろん、溶存酸素濃度やpHでは見つけられないカビの混入も見つけられました(コンタミ開始後115時間かかるけど)。
バキュロウィルス導入区では、増殖中はコントロールと差異がなく、目的ペプチドが発現するようになって差異が出現しました。




モニターが出来てもコンタミを取り除く事は出来ませんが、ずっと新鮮培地を流し続けるような連続的培養であれば被害の拡大を止められそうです。
でもやっぱり除けないんだったら…
ちなみに、ENのセンサーは18種類あって、Acetic acid,Ammonium chloride,Lactate,Methionine,Acetone,Ethanolのそれぞれに3種類ずつあります。

余談ですが、大量培養の場合、メンテナンスなどの理由で金属容器が好まれます。
でもそんな光もないところに押し込められて、その上誰にも見てもらえないまま物を作り続けるなんてかわいそうだし愛が足りてないです。
そういう条件でずっと世代を重ねた細胞系は、そこに適応して可能性の少ないつまらない細胞系になっていく気がします。
もっとも、画一的細胞群の方が工学的に使いやすいのだけど。

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# by koretoki | 2008-12-18 17:24