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2009年 01月 29日

2001年Lynnの「cell lineの作り方」

IN VITRO CELLUAR & DEELOPMENTAL BIOLOGY animal vol.37 No.6 JUNE 2001

十年近く前のものですが、たまたま手に取ったらメンバーが凄かったのでメモ。
1報目は、いっつも名前が出てくるLynn!
Dwigt E.Lynn
Novel techniques to establish new insect cell lines

Graceが1962年に蛾から最初のcell lineを作ってから2001年までに500を超えるinvertebrateのcell lineが作出されてきました。
8割をLepidopteraとDipteraが占めています。
由来組織は、
卵巣:最初のcell lineは卵巣由来。Lepiで一般的。
胚:最も一般的で、cell lineの半分は胚由来。
血球:細胞を手に入れやすいが、増えにくい。
成虫盤:発生学上重要。細胞種が不明。
脂肪体:生理学上重要。肝臓に近い。病原の標的。
中腸:病害と防除に重要。
新生幼虫:胚より発生が進んでいるが、細胞種不明。
その他:クチクラ、神経、内分泌系、筋肉などは病害、防除、生理に重要で研究されているが、cell lineは稀。
一般的なcell lineの作り方は、
(1)70%エタノールで滅菌
(2)滅菌水で洗う
(3)培地に入れる
(4)組織を切り出して新しい培地に入れる
(5)30min-2h血球などを除くため放置
(6)35mmディッシュに培養したい組織片を移す
(7)パラフィルムで封をして、インキュベート
(8)24h-48hで1ml培地足す
(9)7-10dごとに0,5ml培地足す
(10)2,5mlに達したら、(9)を足す、でなく交換に切り替える。
(11)90%くらいのコンフルエントになったら1:2で継代。(※1をprimaryに残し2をsubにする)
最初はantibiotics入りの培地を使うけど、徐々に抜いてくそうです。
そうやって作った培養の組織ごとの特性は、
胚:遊出すくないけど、たまに当たる。エタ滅菌の前に塩素系滅菌も出来る。様々なステージの胚を試すべき。
卵巣:脂肪体の混入を避けるのがポイント。幼虫、蛹、成虫を試す。
血球:脚を切ったりして手に入れるのが容易。メラニン化が脅威なので、阻害剤を入れるか、脱皮の時期でPO活性の下がっている個体を用いるとよい。
新生幼虫:卵の時期に滅菌しておいて、ディッシュの中で孵化し次第切る。メラニン化対策は血球を参考に。
成虫盤:培養に適しているが、小さいのが難点。
脂肪体:様々な細胞が遊出してくる。色々な令や種を試すべき。
中腸:培養難しい。ロエブ式。

他のテクニック
増えてきた細胞の中から特定のタイプの細胞だけを抜き出して、粒のそろってcell lineに。
フィーダー細胞の利用。
低温処理で継代を楽に。



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by koretoki | 2009-01-29 18:01
2009年 01月 29日

ハエはRNAiでテロメア伸長をコントロールする

先日カイコがsRNAでトランスポゾンをコントロールしているという話を紹介しましたがそれに関連した話です。
テロメアに関してもDrosophilaの方が研究が進んでいて、テロメアの伸長がRNAiでコントロールされていることが分かってきました。

Savitsky M, Kwon D, Georgiev P, Kalmykova A, Gvozdev V.
Telomere elongation is under the control of the RNAi-based mechanism in the Drosophila germline.
Genes Dev. 2006 Feb 1;20(3):345-54.

Drosophilaのテロメアはテロメア特異的なレトロトランスポゾンHeT-A,TAHRE,TARTによって維持されています。
HeT-Aは、Drosophilaのテロメアにもっとも多く、Gag-like RNA-binding proteinをコードしたORFを持つ。逆転写酵素(RT)に欠け、TARTのRTに依存している。
TARTのORF2はRTをコードしている。
TAHREはHeT-Aに似ているがORF2を持つ、すなわりRTをもている。

今回著者らはテロメア伸長におけるRNAiの役割を調べるためにRNAiが出来ない変異系統を用いました。
遺伝子spn-E、aubはRNAヘリカーゼ、Argonauteファミリーに属するタンパクをコードしていて、これらがRNAiのために必要です。

著者らは卵巣でのHeT-AとTARTの十分な転写が高頻度のテロメアエレメント染色体末端への結合と関連することをしめしました。
TARTはRNAiの初期対象であるようです。


実験は、変異体のgermlineでテロメア特異的なトランスポゾンの転写をin situ RNA hybridizationで見ました。
RNAiが出来ないspn-E変異体のgermlineのナース細胞で、TARTが転写されるるようになりました。
aub変異体ではナース細胞と生育中の卵巣細胞でTARTが転写されるようになりました。
さらに、複眼の色をマーカーにしてHeT-AとTARTの染色体末端への結合を調べた実験では、変異体で結合が増えることがわかりました。
また、TART、HeT-Aに結合する26-29ntのsRNAについて調べ、細胞内の局在の違いから、sRNAの関連を否定しています。



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by koretoki | 2009-01-29 05:58
2009年 01月 18日

ザリガニが餌も振動もないのに歩き出すのはどうして?

ザリガニはついつい歩いてしまうようです。

Chikamoto K, Kagaya K, Takahata M.
Electromyographic characterization of walking behavior initiated spontaneously in crayfish.
Zoolog Sci. 2008 Aug;25(8):783-92.

ザリガニが歩き始めるとき、物理的・化学的刺激を受けて開始されるreflexivelyなものと、全く刺激が存在しないのに唐突に開始されるspontaneouslyなものがあります。
著者らは、ザリガニの一本の脚の4つの部分に電極を取り付け、それをモニターすることで歩き開始について調べました。

結果、リズミカルな歩きと、non-リズミカルな歩きが検出され、non-リズミカルな歩きはリズミカルな運動の前に起きていることが分かりました。
また、spontaneouslyな歩きの場合、non-リズミカルな歩きを行う時間が長いことも示されています。

足場をなくした場合など、その他の実験区を設定し、以下の結論に至りました。
spontaneousに開始された歩き行動は、脚機械感覚器官からの感覚フィードバックを必要としていて、またそれは、刺激を受けての歩き開始とは異なるの開始機構によって助けられている。




ザリガニを真似てロボットを作ったら、システム上どうしても、たまに突然歩き出してしまう、ということでしょうか?
ザリガニの動きは意味不明ですが、彼らにとってもまた唐突なものであるのは非常に面白いと思います。
この機構が彼らにとってどのような適応的意義があるのか、気になるところです。


やっぱり異分野は難しいです・・・
そしてタグが、ない

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by koretoki | 2009-01-18 15:37
2009年 01月 18日

コロラドハムシ卵由来セルラインは神経由来だった

卵由来のセルラインの場合、どこの組織由来の細胞なのか分からない、という欠点がありますが、それは同時にexplantしにくい、あるいは培養しにくい組織由来のセルラインを樹立できる可能性を秘めています。
今回は、そんな卵由来セルラインのキャラクタリゼーションから、神経由来の細胞であることが推察された話を紹介します。

1996年当時、世界には400の昆虫セルラインが存在し、そのうち鞘翅目由来のものは3つで、また、神経に由来するものは1つもありませんでした。
著者らはジャガイモの害虫であるcolorado potato beetleの卵から、IPLB-CPB2を樹立しました。

Sheppard CA, Lynn DE.
Immunoreactivities for calcium signaling components and neural-like properties of a Colorado potato beetle cell line.
Arch Insect Biochem Physiol. 1996;33(3-4):197-209.

著者らは以下のそれぞれについて抗体を作成し、CPB2にかけて、CPB2がどれも持っていることを示しました。
1、neurofilaments:神経細胞または前駆細胞で見られる細胞骨格
2、type1 inositol trisphosphate receptor:ハエではアンテナとretinaで見られる
3、SERCA2:ポンプ
4、ryanodine receptor:ハエでは胚の筋肉、成虫のventral ganglion、脳表面で見られる

2-4はすべてカルシウムシグナリングに関わるチャンネル、ポンプです。

さらに著者らは、細胞表面の電位をはかりました。
そして、ライトを当てると、電位が変化することを示しました。

保持する細胞骨格、チャンネルタンパクが神経細胞のものであるので、このセルラインは神経由来であると推察されます。
また、活動電位を生じることや光受容体を持つこともその推察の説得力を高めています。
昆虫の場合、光受容体は神経細胞のみで発現するとされています。




神経細胞は農薬のターゲットであるため、コロラドハムシのような農業害虫の神経由来セルラインはスクリーニングに役立ったのだと思います。
また、これらの特性がいつまで維持されるのか、非常に興味のあるところです。

やっぱり細胞に見られてるんだ・・・

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by koretoki | 2009-01-18 14:58
2009年 01月 15日

同じセルラインを違う培地で長期間飼うとどうなるのか

Lynn DE.
Lepidopteran cell lines after long-term culture in alternative media: comparison of growth rates and baculovirus replication.
In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2006 May-Jun;42(5-6):149-52.

用いられたセルラインは3つ。(由来組織、樹立培地)
IPLB-LdFB(gypsy moth fat body,Goodwin's IPL-52B,76(3:1))
IPLB-LdEIta(gypsy moth embryos,上に同じ)
UFL-AG-286(velvethean caterpillar embryos,Grace's medium)

用いられた培地は2つ。
TC-100 (containing 9% fetal bovine serum)
Ex-cell 400 (serum free serum)

3つのセルラインはTC-100で12年、Ex-cell 400で3年(LdFB),12年(LdEIta),1.5年(AG-286)飼われています。
まずはそれぞれのセルラインのそれぞれの培地でのgrowthが測定されました。
結果、
LdFBではどちらの培地でも同程度の増殖、
LdEItaではTC-100で高い増殖、
AG-286ではEx-cell 400で高い増殖が得られました。

次にウィルス感受性が調べられました。
結果、
LdFBではEx-cell 400の方がよく感染しました。
LdEItaでは用いたウィルスの両方でTC-100でよく感染しました。
AG-286では用いたウィルスの片方では差がなく、もう一方ではTC-100でよく感染しました。

さらに、ウィルスの生産性が調べられました。
いずれの培養でも差が少なく、唯一AG-286を用いた実験の片方のウィルスでTC-100の方がsignificantに高い生産性を示しました。

著者は、細胞の高い増殖が得られる培地が、必ずしもウィルス生産にも適した培地とは限らない、と述べています。


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by koretoki | 2009-01-15 03:24
2009年 01月 15日

カイコはsmall RNAでトランスポゾンをコントロールしてる

先日ショウジョウバエのテロメアについてのレビューを紹介しましたが、やはりトランスポゾンをコントロールする方法が存在するようです。

Kawaoka S, Hayashi N, Katsuma S, Kishino H, Kohara Y, Mita K, Shimada T.
Bombyx small RNAs: Genomic defense system against transposons in the silkworm, Bombyx mori.
Insect Biochem Mol Biol. 2008 Mar 27.

small RNAには、microRNAs(miRNAs)、small interfering RANs(siRNAs)などがあり、mRNAの分解、転写抑制、ヘテロクロマチン構成、DNA除去などの役割を担っていると考えられています。
siRNAsはRNAiに関連して有名ですが、長いdouble stranded RNA(dsRNA)をRNase Ⅲ-like enzyme Dicerが約21ntにカットすることで産生されます。
最近small RNAの3番目のクラスとしてpiwi-interacting RNAs(piRNAs)が注目されています。piRNAは26-33ntと、siRNAs(21-23nt)より長く、ArgonauteプロテインファミリーのサブクレードメンバーであるPiwiと会合する特徴があります。
ショウジョウバエのgermlineを用いた研究で、piRNAsがトランスポゾンをサイレンシングすることが分かってきました。

著者らはカイコの卵巣由来RNAsから67,700配列38,493種のsmall RNAを同定し、キャラクターを調べました。



釣ってきたsmall RNAのうち72%の27,815種がカイコゲノムのnew scaffoldと一致しました。完全一致したもののうち46%はrasiRNAにクラス分けされ、これらはゲノム中に5回以上hitするand/or ReASに少なくとも1度反復します。
rasiRNAに分類されたsmall RNAsはlong terminal repeat(LTR)、クラスⅡDNAトランスポゾン、short interspersed nuclear element(SINEs)を含む様々なトランスポゾン因子にhitしました。

SART1とTRAS1はよく解析されたテロメア特異的non-LTRレトロトランスポゾンですが、small RNAsのうちそれらと合致するものはそれぞれ131kinds(387clones),10kinds(11clones)でした。
ショウジョウバエではテロメアがHeT-A,TAHRE,TARTなどのテロメアレトロトランスポゾンによって維持されることが示されていて、かつ、RNAiベースのTARTサイレンシングが起きていることも報告されています。
カイコでも、SART1にhitするrasiRNAsがRNAiベースのテロメア維持に関わっていることが推察されます。



エキロロアンしました。
これはもうやるしかないでしょう

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by koretoki | 2009-01-15 02:52
2009年 01月 10日

イオンチャンネル型匂いレセプターの発見;ショウジョウバエ

昨年の4月に匂い受容体として7回膜貫通型タンパクについての発表がありましたが、ショウジョウバエでは匂いセンサーのニューロンのすべてが匂い受容体としてそれを発現しているわけではありません。
今回著者らは、イオンチャンネル型のグルタミン酸レセプターに関連した未知の匂い受容体を発見しました。

Richard Benton,Kirsten S.Vannice,Carolina Gomez-Diaz and Leslie B. Vosshall
Variant Ionotropic Glutamate Receptors as Chemosensory Receptors in Drosophila
Cell, Volume 136, Issue 1, 149-162, 9 January 2009
著者らはハエのアンテナで発現する遺伝子についてのバイオインフォマティックなスクリーニングから、61の遺伝子ファミリーに注目しました。
分子構造的にグルタミン酸レセプターに似ていたそうですが、よく見ると似てるけどグルタミン酸レセプターではなく、他のリガンドと引っ付くようです。
で、以下の7つの理由で、これを新しい匂いレセプターIonotropic Receptors(IRs)としたそうです。

1、IRsの15のmRNAは成虫のアンテナで特異発現。
2、匂い受容ニューロンの樹状突起でIRs抗体が光った。
3、IRを持つ匂い受容ニューロンはOr83b(7回型)を発現しない。
4、coeloconic小感覚子発達異常ミュータントはIRを発現しない。
5、ニューロンの4つのクラスターのIR発現が、4つのcoeloconic小感覚子の生理学特徴と相関する。
6、通常匂い受容を投射するニューロンは軸索に糸球体一つつくるが、Ir76a-GAL4でラベルした軸索はcoeloconicからの入力を処理するとされる一つの糸球体に収束する。
7、IRをmisexpressionさせると新しい匂い感受性が表れる。

ひとつのニューロンにひとつしか発現しない他の匂い受容体と違って、IRはひとつのニューロンにいくつも発現するそうです。
混乱しない仕組みはどうなっているのでしょうか?
グルタミン酸レセプターと同じ仕組みなら誰がbindしても陽イオン流入して反応してしまうように思うのですが・・・



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バイオインフォマティクスすげー
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by koretoki | 2009-01-10 03:55
2009年 01月 08日

ラッテ骨髄細胞に対するGFとECMの作用の相互関係

細胞がいる微細環境は、主に、液性のgrowt factorと細胞外マトリクスの2つの要素で構成されています。
著者らは、2種類のgrowth factorと1種類の細胞外マトリクスの、骨髄より分離される幹細胞(BMSCs)に対する
効果を定量的に調べました。

Geng T, Sun H, Luo F, Qi N.
Quantitative analysis of the responses of murine bone marrow mesenchymal stem cells to EGF, PDGF-BB and fibronectin by factorial design methodology.
Cytotechnology. 2008 Oct;58(2):93-101. Epub 2008 Oct 21.

細胞はラッテの骨髄より分離したBMSCを
growth factorにはEGFとPDGF-BBを
細胞外マトリクスはfibronectinを用いました。

まず、BMSCが骨形成細胞と脂肪細胞に分化しうることが確かめられ、次に、3種の微細環境構成因子がBMSCの増殖に与える影響を調べました。

結果、EGFとPDGF-BBは単独で増殖を促進しましたが、fibronectinは単独で影響を与えませんでした。
EGFとPDGF-BBを合わせて用いると、拮抗作用しました。
これは、同じレセプターをターゲットにするためと説明されています。
また、growth factorとfibronectinを合わせて用いた場合、用いるgrowth factorがEGFの場合には効果が落ち、PDGF-BBの場合には効果が上がりました。
ここが非常に面白いと感じました。

EGF,PDGF-BB,fibronectinの3つを用いて培養した場合に、細胞の大きさが小さくなり、より細長い形態を示しました。
このデータのために著者らは画像認識ソフトを用いていますが、解析に使われる画像は培養の中から"typical fields"を主観で選択しています。
現行の顕微鏡では培養全体を1度に捉えることは出来ず、解析に用いる視野を決める必要があるのが画像認識ソフトを用いた解析の欠点であると思います。
これが改善されて培養の全体を解析できるようになれば、私も是非使いたいです。



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by koretoki | 2009-01-08 23:44
2009年 01月 07日

ExGen 500は昆虫セルラインへの遺伝子導入においても有効

昆虫セルラインのうち、Spodoptera frugiperda由来のIPLB-SF-21-AEやそのクローンであるSf9、またTrichoplusia ni由来のHigh Fiveが、研究用もしくは商業用としてよく用いられています。

これら鱗翅目由来セルラインへの遺伝子導入方法はリン酸カルシウムをはじめ哺乳類で開発された様々な方法(参考:培養細胞への遺伝子導入法 (石川恵))や、NPVなどのvirusベクター用いる方法がありますが、いずれも毒性や導入効率などそれぞれに欠点があり、新しい方法が求められています。

今回著者らは新規遺伝子導入試薬、ポリエチレンイミン(製品名ExGen™ 500)の昆虫セルラインへの応用を検討しました。
Ogay ID, Lihoradova OA, Azimova ShS, Abdukarimov AA, Slack JM, Lynn DE.
Transfection of insect cell lines using polyethylenimine.
Cytotechnology. 2006 Jun;51(2):89-98. Epub 2006 Nov 2.

導入効率は、ExGen™ 500で導入したGFPがどれだけ光るかを、画像認識ソフトを用いて測定することで評価しています。
Sf9を用いた実験では、半数以上の細胞に導入され、9割ほどの細胞が生存しました。



やっぱり画像認識ソフトは使えるようにならないと、と思いつつ道具を見てみたら、たぶん手元にある・・・
そして、ExGen™ 500!!
これの遺伝子導入機構はかっこいいです。

コスモバイオより
e0160319_0373254.jpg

①ExGen™ 500と目的のDNAが安定で拡散性の高い複合体を形成します。
          ↓
②ExGen™ 500の“水素イオンスポンジ効果”が、大量の水素イオンの蓄積と受動的な塩化物イオンの流入を誘発し、エンドソームのpHを中和します。
          ↓
③浸透圧の膨潤がエンドソームの破裂を引き起こし、目的のDNAが核に移行します。

著者らは、イントロで
カイコ由来セルラインBMNは1種のvirusベクターしか使えないが、Sf9は5種類以上のvirusベクターが使えるから凄い。
と述べているのですが、ExGen™ 500があれば解決されるのでは?



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by koretoki | 2009-01-07 00:39
2009年 01月 04日

切り落とされた足ですら光を受容して概日リズムを刻む

忘年会シーズン、正月を経て私の生活リズムはガタガタですが、ショウジョウバエは脚だけでも正確な概日リズムを刻めるようです。

Plautz JD, Kaneko M, Hall JC, Kay SA.
Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.
Science. 1997 Nov 28;278(5343):1632-5.

著者らは、ルシフェラーゼもしくはGFPをclock遺伝子プロモーターの下部領域に組み込み、概日リズムを可視化して実験を行いました。

結果、ショウジョウバエの頭、胸、腹の組織は、切り出された後も概日リズムを刻み、触角、脚、翅でさえも概日リズムを刻むことが分かりました。
また、光を当てることによってリズムがリセットされるようです(!)。



人間では、ひざの裏で感じる光が概日リズム調整のためのクリティカルな要因になっているという話を聞いたことがありますが、目以外の細胞が光を感じているというのはなんとも不思議な話です。
培養細胞でも概日リズムはあるのでしょうか?また、もしあるとすれば、光を受容して調整する仕組みまで保存している細胞系はどれほどあるのでしょうか?
なんだか細胞に見られてるような気がしてきました(笑



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by koretoki | 2009-01-04 06:39