したっぱ昆虫細胞研究者のメモ

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2008年 11月 29日

免疫の学習の主役は血球です

昆虫は抗体を持たず、人間が持つ後天免疫を持ちません。しかし、最近の研究では、昆虫の自然免疫系にも、適応しながら働く性質があることが示唆されてきました。また、ある菌の侵攻を受けた雌の子どもが、その菌に対する耐性を持つ現象も見つかっています。
著者らは、同じ病原に対する2度目の応答の適応が、AMPsではなく、血球の貪食作用によることを示しました。

Linh N.Pham,Marc S.Dionne,Mimi Shirasu-Hiza,David S.Schneider
A Specific Primed Immune Response in Drosophila Is Dependent on Phagocytes
PLoS Pathogens March2007 Vol.3 Issue 3 e26
まず、肺炎球菌Streptococcus pneumoniaeを用いた「予防接種」が有効であることから、ハエの免疫応答が適応することを示しました。

次に、ある病原への適応が、他の病原への適応を引き起こすかどうかしらべるため、熱処理した菌で予防接種した個体に、病原を与え、生存率を見ました。
結果、引き起こすことはなく、また、半分以上の菌では、その菌に対する適応すら引き起こしませんでした。
むしろ肺炎球菌のほうが特別なようです。

そこで、肺炎球菌以外の菌で予防接種した個体が肺炎球菌への適応を示すか調べました。こっちも起こりませんでした。
こうして、肺炎球菌がハエの肺炎球菌耐性を特異的に誘導する事が分かりました。


ハエの免疫系では、Toll pathwayとimd pathwayが良く研究されています。そのどちらが免疫の適応に効いているのかを調べるために、それぞれの欠損ミュータントを用いて予防接種の実験を行いました。
結果、Tollがクリティカルな要因で、imdは免疫適応に必要ないことがわかりました。

最後に、液性応答(AntiMicrobialPeptide)、細胞性応答のどっちが免疫適応に関わるのかを調べました。
肺炎球菌に暴露した時のdefensin転写量をqRT-PCRで測り、肺炎球菌がdefensinの転写をあまり誘導しない事と、AMPは1週間も経つとピークが消えてしまって、これは免疫適応の持続時間と合わないことからAMPは免疫応答のcriticalな要因でないことが示されました。
また、ビーズ(貪食の対象となる)の挿入による血球の貪食の阻害が、肺炎球菌暴露個体の生存率を下げる事が、貪食が免疫適応に必要であることを示しました。
予防接種の際にビーズを与えると免疫適応が阻害される事も上記の考えを支持します。

ちなみに、肺炎球菌で予防接種した個体のE.coliに対する適応は、起こりませんでした。




植物では、ある病原の侵入が防御系全体の活性を高めること、が大事らしいので、やっぱり違うんだなと思いました。
あと、一般的に昆虫の免疫はこうだ、というよりかは病原の種類によって活躍する免疫の種類が違うって話の方がしっくりくると思います。

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by koretoki | 2008-11-29 04:24
2008年 11月 27日

免疫による自傷<マルピーギ管の場合>

昆虫の自然(innate)免疫は、体液性の免疫、メラニン化、細胞性免疫で構成されています。
液性免疫であるフェノールオキシダーゼがもたらす自傷を避けるため、周辺の組織表面をメラニン化して守る働きが観察されますが、著者らは、これが組織を障害すると考えました。

Ben M.Sadd and Michael T.Siva-Jothy
Self-harm caused by an insect's innate immunity
Proc.R.Soc.B(2006)273,2571-2574

実験にはチャイロコメノゴミムシダマシtenebrio molitorが用いられました。isofemale lineの中から、体重が0,10-0,11gの個体のみを選んで使いました。
e0160319_12171216.jpg

まずは、免疫反応によるメラニン化を、他個体から移植したマルピーギ管で観察しました。
免疫反応はナイロンファイバーで誘導しました。
図のように、ナイロンファイバーの近くに移植されたマルピーギ管の方が、激しくメラニン化されました。ナイロンファイバーを挿入されていない個体に移植したマルピーギ管はメラニン化されませんでした。
e0160319_12172431.jpg

つぎに、ナイロンファイバーを挿入した個体のマルピーギ管と、ナイロンファイバーを挿入するのに十分な穴を開けた(NF入れない)個体のマルピーギ管の運動を比べました。
マルピーギ管のアッセイには、図にしめした'oil drop'テクニックが用いられました。
実験はnatural oilの中で行います。
マルピーギ管の一端は生理食塩水に浸たし、もう一端を浸さないようにします。
すると、マルピーギ管の蠕動運動によって一端から生理食塩水がマルピーギ管の中を通り、矢印の方向に反対の端に運ばれます。
そうして出来た油の中の生食の雫の量をを、画像処理によって測り、その大きさをマルピーギ管の元気さの指標としました。
結果、ナイロンファイバーを挿入した群は、挿入しない群より有意に元気がなくなりました。
グラフを見ると大体2/3くらいになっています。



a modified 'oil drop' techniqueかっこいいです

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by koretoki | 2008-11-27 12:20
2008年 11月 26日

抗生物質はいきなり使うものじゃない

昆虫が体内に分泌する抗生物質は、侵入する微生物を殲滅するというよりかは、血球が食べた後に体内に残ってる微生物を抑えるためでした。
Eleanor R. Haine,Yannick Moret,Michael T. Siva-Jothy,Jens Rolff
Antimicrobial Defense and Persistent Infection in Insects
Science 21 November 2008:Vol. 322. no. 5905, pp. 1257 - 1259

日本語abstがついてたので貼り↓
 昆虫が地球上に存在するようになって4億年間、昆虫の持つ強力な抗菌性免疫防御機構に対して、細菌が抵抗性を進化させて、昆虫が死滅したことはほとんどない。今回われわれは、感染後の細菌排除が極めて速やかにおこり、かつ誘導性の抗菌活性が上昇し始めるのは、大部分(99.5%)の細菌が駆逐された後のみであることを発見した。われわれの実験により、昆虫の恒常的な免疫応答を受けて生き残った細菌は、その後に抵抗性が高まることが判明した。これらの結果から、誘導された抗菌物質は細菌感染の解消に働くのではなく、おもに昆虫の体内に持続的に存在する細菌から昆虫を守るために機能していることが示唆される。これらの発見は、自然界においてどのように抗菌ペプチドが用いられているかを理解することで、薬剤抵抗性のリスクを回避する治療戦略が明らかになる可能性を示している。



昆虫が微生物の侵入を受けた時、いつもONになってる「血球やフェノールオキシダーゼを用いた防御」と、侵入を受けて誘導される「抗生ペプチド分泌による防御」の2つの反応が起こります。
後者の誘導性の反応は、被侵入後1-3時間経って誘導されます。その後12-48時間後にピークを迎え、1週間以上残ります。
免疫反応には、多くのコストがかかるため、このような長期に渡る反応には、適応的な意義があると考えられてきました。
しかし、最近、ショウジョウバエで、同じ微生物2度目の侵入の際に、抗生ペプチドよりも血球が多く働いていることがわかりました。
一方で、著者らは、長期に渡る抗生ペプチドの働きが、血球に耐性を持った微生物を仕上げるためだ、と提唱してきました。

これらの前提に立って、3つの予想を立てました。
1:微生物のほとんどは抗生ペプチドが誘導される前に殺される。
2:いくらかの微生物は血球から逃れて生き残る。
3:そうして生き残った微生物は寄主の免疫に高い耐性を持つ。

確かめるために実験をしました。
実験には甲虫のTenebrio molitor雌成虫とStaphylococcus molitorを使いました。

まず、虫に注入した多量の菌の生存率を調べました。
結果、菌の99,5%が最初の30分で死にました。
次に、菌を注入した虫の血液を取り、そこから細胞を取り除いたものの、殺菌活性を調べました。
結果、1時間後から活性が出始め、1日ほどでピークを迎えました。7日目から下がり始めましたが、28日目でもピークの1/5ほどの活性を保っていました。
これで仮説1が説明されました。


続いて仮説3の説明です。
著者らは「虫に注入して生き残った菌」と「虫に注入してない菌」を、感染の経験のない虫に注入し、菌の生存率を調べました。
結果、「注入して生き残った菌」が有意に多く生き残りました。


こうして、抗生ペプチドが血球の食べ残しの微生物を抑えるために産生されている、という考えが示されました。

特に説得力があったのは、抗生ペプチドについて「次の侵入に対する予防、という説明では最低2回の侵入が必要である。しかし、食べ残しを抑える、という説明なら、1回の侵入で十分である。」とした節です。


カブトムシのディフェンシンだったらこれで説明が付く気がしますが、モンシロのピエリシンはどうなんでしょうね??
今回は、微生物に関する話でしたが、昆虫の防御は寄生蜂にもベクトルが向いてると思います。
それも含めてきりっと説明できたらかっこいいですね


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by koretoki | 2008-11-26 13:54
2008年 11月 25日

JH単独で細胞増殖阻害をする場合

ノシメマダラメイガ成虫盤由来細胞系、IAL-PID2を使った論文3報目。

H.Oberlander,C.E.Leach,E.Shaaya
Juvenile hormone and juvenile hormone mimics inhibit proliferation in a lepidopteran imaginal disc cell line
Journal of Insect Physiology 46(2000)259-265

著者らは、JHとJH類似物を培養細胞に与え、細胞増殖が邪魔されるのを観察しました。
JH1,JH3,methoprene,fenoxycarb,linoleic acid(control)が10,50,100ug/mlの力価で添加されました。
JHを培地に溶かすことは難しいので、一度アセトンに溶かしたサンプルを、脂肪酸フリーのアルブミンに吸着させ、それを培地に溶かす方法を取りました。

結果、JH1の場合、50ug/ml以上の時、増殖阻害が起こりました。JH3では、100ug/mlの時だけ増殖阻害が起こりました。
Methopreneでは100ug/mlの時だけしか増殖阻害が起きない一方、Fenoxycarbでは50ug/ml以上で増殖阻害が起きました。
Methopreneの方がFenoxycarbよりも、JHに似た構造なのに、Fenoxycarbの方が低濃度で効いたのは面白いところです。

また、論文の増殖曲線はNijhoutの提唱する、「JHの効果はpresence or absenceが重要で、血中濃度に比例しない」という考えに適合しています。

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by koretoki | 2008-11-25 12:53
2008年 11月 23日

エクダイソンが細胞増殖を制御するpathway

Siaussat D, Bozzolan F, Porcheron P, Debernard S.
The 20-hydroxyecdysone-induced signalling pathway in G2/M arrest of Plodia interpunctella imaginal wing cells.
Insect Biochem Mol Biol. 2008 May;38(5):529-39. Epub 2008 Jan 19.

e0160319_1431091.jpg


著者らは、RNAiを使って20Eと関連する3つの転写因子EcR、USP、HR3の関係を調べました。
20Eのシグナル系が有効であるか向こうであるか、は培養細胞のうちG2/M期にあるものの数で見ました。
また、PiCycBの機能を調べるため、上記3つの転写因子単独のRNAiと、それぞれとPiCycBを一緒にRNAiしたときを比べました。
結果、EcR、USP、HR3がBcyslin合成を制御して細胞の増殖をコントロールしていることが分かりました。

著者らは2007年の論文
Siaussat D, Bozzolan F, Porcheron P, Debernard S.
Identification of steroid hormone signaling pathway in insect cell differentiation.
Cell Mol Life Sci. 2007 Feb;64(3):365-76.
において、EcR、USP、HR3がβtubulinの発現促進によって分化を促進すると述べています。


この2つの論文によって、20Eが細胞の傾向を増殖から分化にシフトしていくための、「分裂の抑制」と「分化の促進」の両方の働きについて簡単な図にまとまりました。
左のpathwayが2007、右のが2008のものです。
左は細胞の形態的変化、右は細胞の細胞周期の変化をみることで行われました。

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by koretoki | 2008-11-23 14:29
2008年 11月 20日

ポリドナvirで甲虫細胞系に遺伝子導入

寄生蜂が寄主に寄生するためには、寄主の免疫系を制御する必要があります。
その因子として、venomやpolydnavirusが知られています。
polydnavirusを遺伝子導入のベクターとして用いたお話です。

D.Gundersen-Rindal,D.E.Lynn,and E.M.Dougherty
TRANSFORMATION OF LEPIDOPTERAN AND COLEOPTELAN INSECT CELL LINES BY GLYPTAPANTELES INDIENSIS POLYDNAVIRUS DNA
In Vitro Cell.Dev.Biol-Animal 35:111-114,February 1999

著者らは、gypsy mothの寄生蜂であるGlyptapanteles属の蜂のpolydnavirusを用いました。
実験には、Glyptaの寄主であるgypsy moth胚由来2つ、gypsy moth幼虫脂肪体由来1つ、Ti.ni.(Lepidoptera)胚由来1つ、Sp.fr.(lepi)蛹卵巣由来1つ、Pl.in.(lepi)翅成虫盤由来1つ、He.vi.(lepi)精巣由来1つ、Di.un.(Coleoptera)胚由来1つ、Tr.co.(Hymenoptera)胚由来2つ、Ae.al.(Diptera)卵由来1つ、計11の細胞系が用いられました。

それぞれの培養に対し、寄生蜂Glypta indiensisのメスの2つの卵巣と毒腺を添加し、観察、PCRによる遺伝子導入の確認を行いました。


結果、寄主を含む全てのLepidoptera由来細胞系とColeoptera由来の細胞系でpolydnavirusによる遺伝子導入が確認されました。
また、細胞系の由来組織の違いによる導入の可否はありませんでした。

細胞の形態や、増殖能はvirus添加後1週間は顕著であり、1-2ヶ月も経つとほとんど分からなくなってしまいました。
大体100回継代くらいまでは導入されたvirusの存在が確認され、特に長いものだと300回継代後でも確認されました。



lepiを狙った寄生蜂の持つpolydnavirusが、全く関係なさそうなcoleoの細胞に導入される―それなのに、HymeとDiではダメだというのがとても面白かったです。


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by koretoki | 2008-11-20 20:07
2008年 11月 20日

雌アリはいっぱい交尾したい

ひとつの遺伝的多型(日本語おかしい:single genotype)から複数の表現型多型が出現する仕組みはわかっていません。
著者らは、表現型の可塑性が親の遺伝的背景に影響されるを調べました。
Tanja Schwander and Laurent Keller
Genetic Compatibility Affects Queen and Worker Caste Determination
SCIENCE Vol.322 24 October 2008

アカシュウカクアリのコロニーをいくつか用意し、それぞれから雌雄の生殖虫を1頭ずつ取り出し、1回だけ交尾させた後、産まれた個体の表現型を調べました。
結果、組み合わせによって産まれた個体の生殖虫/労働虫の割合が大きくばらつきました。
おどろくことに、8割が生殖虫になってしまう組み合わせすらあります。

メスは多回交尾をしなければ、カーストの割り振りが偏ったコロニーをつくることになってしまうようです。
著者らは、このことが多回交尾を進化させたと述べています。

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by koretoki | 2008-11-20 01:58
2008年 11月 19日

アンチエイジングには、テロメアーゼと制がん遺伝子

テロメアーゼの過剰発現で、マウスの寿命が延びたようです。

Tomás-Loba A, Flores I, Fernández-Marcos PJ, Cayuela ML, Maraver A, Tejera A, Borrás C, Matheu A, Klatt P, Flores JM, Viña J, Serrano M, Blasco MA.
Telomerase reverse transcriptase delays aging in cancer-resistant mice.
Cell. 2008 Nov 14;135(4):609-22.

テロメア構造は生物の寿命に関連すると言われています。
ヒトやマウスでテロメアを伸張させている酵素テロメアーゼの過剰発現は、培養条件下の細胞の分裂回数を無限にすることが知られています。
しかし、個体での機能については、テロメアーゼの発現が発がんイニシエーションとなるため、調べる事が困難でした。
この問題を回避するため、著者らは、がん耐性のあるマウス作製しました。
このマウスはがん抑制遺伝子である、p53、p16、p19ARFを過剰発現することで、がんに耐性を持っています。
このマウスで、テロメアーゼを過剰発現させると、加齢に伴う全身の衰えを改善しました。

最大で40%ほど寿命を延ばせるようです。
培養細胞のように不老不死というわけにはいかないのでしょうか。



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by koretoki | 2008-11-19 18:18
2008年 11月 18日

アブラムシのJHtiterをLCMSで測る

アブラムシには翅があるやつとないやつがいます(有翅型、無翅型)
著者らは、2つの型で血中JH濃度の差がないことを示しました。

Schwartzberg EG, Kunert G, Westerlund SA, Hoffmann KH, Weisser WW
Juvenile hormone titres and winged offspring production do not correlate in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.
J Insect Physiol. 2008 Sep;54(9):1332-6. Epub 2008 Jun 26.
有翅型の個体とその親、無翅型の個体とその親についてJHtiterを調べました。

著者らは、アブラムシの足か触角を切り、体を圧迫して滴状に出てきた血液をキャピラリーで集めました。それを6ー12頭やって1μlになったら、それを100μlのmethanol/isooctane(1:1)に入れ、またスタンダードとしてmethopreneも入れます。
調整後濃縮して、島津のLCMS-2010Aで分析しました。

結果、JH3のみが検出され、その濃度は30-163pg/μlでした。
有翅型と無翅型の間に有意な差はありませんでした。


LCMSにいろんなものを入れてみたくなりました。
ちなみに、この方法で測れるのは12pg(検出限界)から40pg(定量限界)のものまでだそうです。

そういえば
サバクトビバッタの孤独相群生相スイッチには、卵巣ろ胞細胞、精液小胞、食道下神経節の神経分泌細胞に存在する6kD のペプチドが関連しているそうです。下記の論文では免疫染色で局在を確認したペプチドについて、MSをとることで擬陽性を除いています。
M.M.Rahman et al.
Localization of the phase-related 6-kDa peptide(PRP) in different tissues of the desert locust Schistocerca gregaria -Immunocytochemical and mass spectrometric approach
Journal of Insect Physiology 54 (2008) 543-554

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by koretoki | 2008-11-18 14:47
2008年 11月 17日

Eカドヘリンが幹細胞のpluripotencyを制御する場合

ES細胞を始めとする幹細胞の分化全能性に、culture growth factor environmentとcell-cell interactionがクリティカルな役割を果たしていました、という論文。

Chou YF, Chen HH, Eijpe M, Yabuuchi A, Chenoweth JG, Tesar P, Lu J, McKay RD, Geijsen N.
The Growth Factor Environment Defines Distinct Pluripotent Ground States in Novel Blastocyst-Derived Stem Cell
Cell. 2008 Oct 31;135(3):449-61.

ES細胞は陥入前のblastocystのInnerCellMassからつくります。
陥入後のblastocystからつくる幹細胞は、EpiS細胞です。
マウスのEpiS細胞はマウスのES細胞よりヒトのES細胞に似ています。
これらの関係から、著者らは細胞のpluripotencyが、決まったものではなく、環境によるところが大きいと考えました。

著者らは、ES細胞をつくるときのと同じICMに3種のgrowth factor(GF)を作用させ、新規のblastocyst由来幹細胞を樹立しました。
3つのGFの名前、bFGF、Activin、BIOからFAB-S細胞と名づけました。
マウスのES細胞が立体的なコロニーをつくるのに対し、FAB-S細胞は単層のコロニーをつくりました。
また、FAB-S細胞は維持のためにLIF、Bmp4といったGFや血清を必要としませんでした。

遺伝子発現を他の幹細胞と比べると、pluripotencyに関連する遺伝子(Oct4,Nanog,Sox2)は共通でしたが、FAB-S細胞には胚細胞の分化に関わる遺伝子(Stella,Blimp1,Daziなど)がありませんでした。
さらに、FAB-S細胞はtelatomaをつくる事が出来ませんでした。
telatomaをつくれないとpluripotencyは認められません。

しかし、FAB-S細胞に2つのGF(LIF,Bmp4)を加えたことろ、telatomaをつくり、またキメラマウスを作出することも出来るようになりました。
その後、LIFとBmp4抜きの培養を行っても、FAB-S細胞はtelatoma、キメラ共につくりました。

著者らは"partial pluripotency"と書かれていますが、GFによってpluripotencyが獲得されるところがすごく面白いと思います。


次に、ふつうのFAB-Sと、GFによってpluripotencyを得たFAB-Sとの比較が行われました。
結果、前者でEカドヘリンの発現が低いのに対し、後者は高い発現が見られました。
実際にふつうのFAB-SにEカドヘリンを過剰発現させるとpluripotencyが備わったので、EカドヘリンがFAB-Sのpluripotencyを制御していることがわかりました。


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by koretoki | 2008-11-17 14:43