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2009年 12月 02日

細胞の個性が決まる仕組み

セルラインのように、同一の細胞から由来する細胞の集団の中にも不均一性が生じることが知られています。例えクローニングをしたとしてもそのラインの中で新たな不均一性が生じます。これまで、こういった細胞集団の不均一性は転写やリン酸化を指標に調べられてきましたが、不均一性の原因について解明した研究はありませんでした。
今回著者らは、①接種したウィルスの感染の有無を細胞の状態を示す指標として用い、②培養の映像から細胞の大きさや密度といったパラメータを抽出し、③それらパラメータと細胞の状態についての膨大なデータをニューラルネットワークの学習を用いることで解析することで、細胞の状態とパラメータの関係の概要を導きました。

Snijder B, Sacher R, Ramo P, Damm EM, Liberali P, Pelkmans L.
Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.
Nature. 2009 Sep 24;461(7263):520-3.

実験には、HeLa, A431, MCF10Aといったセルラインが用いられました。また、ウィルスはSV40, Rotavirus, Dengue virusなどが用いられています。著者らは、同一実験条件化で培養されたセルラインにウィルスを接種した場合に、細胞によって感染したりしなかったりすることに注目し、ウィルスの感染が細胞膜の性質に大きく依存することから、ウィルス感染の有無を細胞の状態、特に細胞膜の状態を示す指標になると考えたようです。
撮影された培養の映像から、Population size, Local cell density, Cell islet edges, Cell size, Mitotic state, Apoptotic stateの情報を抽出し、これと接種した各ウィルスの感染の状態をデータとしました。

今回用いられたBootstrapped Bayesian network learning法は、ニューラルネットワークという数学モデルに基く手法で、私が扱うような通常の統計的手法―正規分布やポアソン分布といった何らかのデータの特徴を仮定する方法―と比べて、データの特徴を手法が提出してくれるという点で特に大きく異なっています。(らしいです。)

e0160319_25832.jpg


解析の結果、細胞の集団内の位置から、細胞の状態を説明する方法が発見されました。




iPSを選別する画像処理技術は既に開発され、商品化に向けて研究中と聞きます。(http://d.hatena.ne.jp/Trick_or_treat/20090410)
私は、細胞培養技術の煩わしい点のひとつに、細胞の培養を行う―単に植え継ぎ操作をするという意味ではなく、実験の目的に適う良くコントロールされた状態に培養細胞を保つこと―ために訓練が必要なことがあると考えています。そして、細胞の状態を見る目を養うことも訓練の一部ですし、またそうやって養った目に個人間の差異がある可能性もあります。
画像認識のような中立かつ非侵襲の方法が、細胞培養をより安定な技術とするに違いないと期待しています。


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by koretoki | 2009-12-02 02:05
2009年 09月 04日

同じc-DNAから組み換えCYPを作っても、昆虫細胞とヒト細胞の場合でkineticsが違ってくる

研究したい蛋白質のc-DNAから、微生物や細胞系を利用して組み換え蛋白を得ることは広く行われていますが、研究対象が酵素の場合は注意なようです。
Christensen H, Mathiesen L, Postvoll LW, Winther B, Molden E.
Different enzyme kinetics of midazolam in recombinant CYP3A4 microsomes from human and insect sources.
Drug Metab Pharmacokinet. 2009;24(3):261-8.

 ヒトCYP3A4はヒトの肝臓と腸で最も多いCYPで、治療薬などの分解に寄与していることで知られています。この研究ではCYP3A4が催眠鎮静薬であるミダゾラムを分解する酵素kineticsについて注目し、ヒト細胞と昆虫の細胞でそれぞれ発現させたミクロソーム内組み換えCYP3A4を比較しました。著者らはそれぞれのCYP3A4を基質であるミダゾラムと反応させて、主生成物である1'-hydroxymidazolam(1'-OH MDZ)と副生成物である4-hydroxymidazolam(4-OH MDZ)の量をLC-MSで測定し、Km値(ミカエリスメンテン定数?)とVmaxを求めました。結果、1'-OH MDZを生成する際に、ヒト細胞由来recCYP3A4は典型的なミカエリスメンテンkineticsを示し、一方で昆虫細胞由来recCYP3A4は基質阻害kineticsを示しました。総じてヒト細胞由来recCYP3A4は昆虫細胞由来に比べて高いKm値を示し、このことはvivoの状況と関連するので重要だと述べています。



 組み換え蛋白発現で酵素を作る場合に、異なる補助因子の影響が注目されてきていて、例えば、電子供与蛋白であるcytochrome b5はc-DNA発現させたCYP酵素活性に影響を与える重要な因子として同定されているそうです。もちろん著者らはcytochrome b5にも配慮して実験を行っています(昆虫細胞区ではwith and without coexpressed cytochrome b5の2つが設定されていたり)。HoustonとKenworthyの仮説に"異なるrecombinant sourceでは酵素の活性部位が違う"というのもあるそうです。異種昆虫間でも同じことが起こるのでしょうか?ハエの酵素をSf9に作らせたら違った、とか、錦秋鐘和のを大造由来セルラインに作らせたら違った、とか・・・

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by koretoki | 2009-09-04 03:15
2009年 09月 02日

月砂埃、吸っても大丈夫?

Jacqueline A. Jordan, Ashley M. Verhoff, Julie E. Morgan and David G. Fischer
Assessing the in vitro toxicity of the lunar dust environment using respiratory cells exposed to Al2O3 or SiO2 fine dust particles
In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal Published online: 18 August 2009

 月の表面を覆う土壌は細胞よりも小さな粒子で成り立っており、なかにはミトコンドリアより小さいものもあるそうです。これまで、そういった微細な粒子を吸引することは、慢性的で重篤な呼吸器傷害を引き起こすと考えられてきました。実際に、宇宙飛行士からそういった苦情もあったそうです。

 今回著者らは、月土壌の約半分を占めるSiO2と1割程度を占めるAlO2をin vitroで、マウス肺胞マクロファージとヒトⅡ型表皮細胞に添加し、細胞毒性を調べました。SiO2を高濃度(5mg/ml)で加えた場合のみ傷害がありましたが、総じて毒性は見られませんでした。著者らは、他の月土壌構成成分についての調査と、器官培養や3次元培養などでのさらなる調査が必要だと述べています。 
 
 

細胞毒性がないことがガス交換の仕事を邪魔しないことにはならないってことでしょうか?



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by koretoki | 2009-09-02 02:53
2009年 08月 28日

微重力でES細胞の分化抑制

Kawahara Y, Manabe T, Matsumoto M, Kajiume T, Matsumoto M, Yuge L.
LIF-free embryonic stem cell culture in simulated microgravity.
PLoS One. 2009 Jul 23;4(7):e6343.

 先日紹介させていただいた微重力が胚発生に及ぼす影響に出てきた3Dクライノスタットを作ったLouis Yugeさんが同装置を用いて行ったES細胞に関する研究です。

 Leukemia inhibitory factor(LIF)はES細胞の多分化能を維持する為に利用されますが、再生医療などの目的でES細胞を用いたい場合にはそういった物質の利用なしにより安全な調製が望まれます。著者らの行った過去の研究で微重力が骨芽細胞の分化を抑制することが分っていました。そこで、この研究では微重力下で培養することでES細胞をLIF-freeで維持することを試みました。

 LIF抜きのfeeder-free and serum-free ESF-C mediaを用いて1GでES細胞飼ったところ、形がES細胞と異なってしまいました。同じ培地を用い、μGでES細胞飼ったら形は通常のES細胞一緒で7日で8倍に増殖しました。真にES細胞であるか調べる目的でAlkaline phosphataseで染めたところ、ES細胞と同じ性質を示しました。また、1Gの区画では3日後にSox2の、7日後にOct-4,Nanogの発現が減少したのに対し、μGではそれらの減少は起こりませんでした。また、テラトーマテストも行い多分化能を示しています。



 機械の世界では、無重力下であればより精密な工作が出来るんじゃないか、というような研究も行われているそうですが、細胞の世界でも微重力環境を利用してこれまで作れなかったものが作れた、というのがとてもいいと思いました。そのうち微重力工場なんてのも出来るかもしれませんね。補足ですが、3Dクライノスタットは装置内の物体にとっての重力を球状に回転させることで”時間当たりの”重力を0にするものらしいです。映画の宇宙飛行士が訓練で乗ってるクルクル回る椅子みたいなものですね。重力を打ち消す、というわけではないようです。μGというのは装置内に加速度計でも入れて測定したんじゃないかと推測しています。
 

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by koretoki | 2009-08-28 17:40
2009年 08月 27日

免疫細胞に選択的に感染するrecバキュロウィルスベクター

Martyn JC, Cardin AJ, Wines BD, Cendron A, Li S, Mackenzie J, Powell M, Gowans EJ.
Surface display of IgG Fc on baculovirus vectors enhances binding to antigen-presenting cells and cell lines expressing Fc receptors.
Arch Virol. 2009;154(7):1129-38. Epub 2009 Jun 26.

 バキュロウィルスは哺乳動物細胞に対して細胞傷害を示さない為、ベクターとして広く利用されています。組み換えバキュロウィルス(以下recBV)を用いて肝炎ウィルスの蛋白をマウスの細胞に導入すると、抗体の産生と、細胞仲介性の免疫反応を示すことがわかっています。
 そして、バキュロウィルスの表面に任意の蛋白を提示させることで、提示された蛋白と結合するモノを表面に持った細胞に選択的に感染させる方法も研究されてきました。今回著者等は、Bリンパ球やマクロファージの細胞膜上にあって、抗原提示や貪食の過程を仲介するIgG Fc受容体を狙うため、表面にIgG Fcを提示するrecBVを作りました。


 著者らは2つのカセットを持った組み換えバキュロウィルス(recBV)を設計開発しました。昆虫細胞に感染させるとIgG Fcを発現し、哺乳類細胞に感染させるとhepatitis C virusの構造蛋白を発現します。IgG Fcは昆虫細胞内において、シグナル配列と、膜貫通部位(バキュロウィルスのエンベロープ蛋白であるgp64、もしくはヒトトランスフェリン受容体)との融合蛋白として発現し、typeⅠもしくはtypeⅡ複合膜蛋白となります。いずれの場合も、IgG Fcは細胞膜上に配置される蛋白の組み換え型として発現し、細胞膜の表面にくるようになります。どちらのrecBVも、水に溶いたFcγRⅡα受容体とセルラインとFc受容体を発現する抗原提示細胞に特異的に結合しました。Fc受容体を発現する免疫細胞を標的とするこれらの新しいバキュロベクターは、ワクチン産生と遺伝子治療への利用の可能性を持っています。



ウィルスの表面に何かを提示させて、それに相対する何かを持った細胞を狙うっていうコンセプトがとてもcool!免疫細胞を狙ったのも面白いです。こういう話大好きです。


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by koretoki | 2009-08-27 23:50
2009年 08月 26日

微重力が胚発生に及ぼす影響

mixiニュースで「宇宙 子ども生まれる確率低く」とあったので。
PLoS ONE Published 25 8 2009
Detrimental Effects of Microgravity on Mouse Preimplantation Development In Vitro
Sayaka Wakayama, Yumi Kawahara, Chong Li, Kazuo Yamagata, Louis Yuge, Teruhiko Wakayama


 著者らは卓上で1/1000G環境を構築できる「3Dクライノスタット」を用いて、マウス胚発生に微重力環境が及ぼす影響を解析しました。まず、100mlほどのフラスコに40mlの培地を入れ、微重力条件下でin vitro授精を行います。そのまま微重力条件下で培養し、6h経過(zygote),24h経過(2-cell),96h経過(blastocyst)を回収しました。それぞれを観察するほか、2-cellとblastocystに関してはマウス胎内に挿入し発生を観察しました。結果、微重力条件下で培養を行った胚では出生率が下がることが示されました。

 

 100mlのフラスコに40mlの液を入れて微重力にするとちゃぽんちゃぽんしてしまうのでは?vivoでは着床するはずの受精卵が、プラスティックに何度も擦り付けられたらダメになるんじゃないか、と思ったら、Discussionに「胚にぴったりサイズのマイクロチャンバーを使ったりすることで培地の多いことによる負の効果を取り除けたら、この結果が真に微重力の効果を示せるのに」と書いてありました。確かに100mlのフラスコ(たぶんFalconの青いキャップの12.5cm2のやつ。フィルター換気穴付き)に20mlは多すぎますよね。換気穴のフィルターに培地が付いてpHが気まずくなったりしないんでしょうか?

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by koretoki | 2009-08-26 07:41
2009年 08月 20日

百聞は一見にしかず

情報技術によって動画のやり取りが容易になり、我々も頻繁に動画でデータを取るようになりました。でも、動画のジャーナルがあるとは知りませんでした。

Journal of Visualized Experiments

まるでNHKの教育番組
下の論文ではDrosophilaのグリア細胞が移動する様子が撮影されています。

Cafferty P, Xie X, Browne K, Auld VJ.
Live imaging of glial cell migration in the Drosophila eye imaginal disc.
J Vis Exp. 2009 Jul 9;(29). pii: 1155. doi: 10.3791/1155.

IntroでAuthorが登場するのが面白いです。
そしてMat & Methがもの凄く分かりやすいです。



無料トライアルで見ましたが、課金してしまおうかと悩んでます。

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by koretoki | 2009-08-20 22:59
2009年 07月 29日

マリアナ海溝より深い海の水圧でも平気:コンゴウウナギのセルライン

高水圧の環境に住む生き物の細胞は圧力に強いのでしょうか?
深海魚であるコンゴウアナゴの細胞を用いて検証した研究があったので紹介します。

Koyama S, Kobayashi H, Inoue A, Miwa T, Aizawa M.
Effects of the piezo-tolerance of cultured deep-sea eel cells on survival rates, cell proliferation, and cytoskeletal structures.
Extremophiles. 2005 Dec;9(6):449-60.

著者等はコンゴウアナゴ、アナゴ(conger eel)、マウスセルライン3T3-L1の3種の細胞を用い、圧力に対する細胞の反応を生存と増殖について見ました。

 生存率を調べる実験では、急激な加圧の後20分間維持し、その後急激に減圧させています。マウスの細胞が60MPaで、アナゴの細胞が130MPaで死滅するのに対し、コンゴウアナゴの細胞は150MPaでも生存でき、完全に死滅したのは200MPaでした。加圧に伴う細胞骨格分子の応答を抗体を用いて観察した実験では、マウスやアナゴの細胞のアクチンがすみやかに脱重合してしぼんだ形態を示すのにたいして、コンゴウアナゴでは100MPaでほとんど変化せず、130MPaにおいて若干くずれました。

 増殖を調べる実験は、0MPaから30MPaまでの加圧条件で培養することで行っています。アナゴの細胞では、加圧するほどに細胞増殖能が失われ、10MPaで完全になくなりました。マウスの細胞では、5MPaまでは上昇し、その後減少して18MPaほどで増殖能を失っています。コンゴウアナゴの細胞では20MPaまでは一定で、その後減少し30MPaで増殖能を失いました。20MPa条件下での分裂にはM期に少なく見積もっても480min.かかるようです。




高圧環境にすむ生物の細胞は裸でも高圧に耐えられるっていうのがすごく面白かったです。環境に合わせて、体細胞の基本的な性質も大きく変化しているのですね。

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by koretoki | 2009-07-29 18:58
2009年 06月 19日

血清フリーの培地で骨格筋の分化を追いかけるモデルができました

成分が全て同定された完全合成培地での培養は、細胞の維持に必須な要素、あるいは変化を誘導する要素の解析のために重要です。
今回著者らは、グロースファクターなどの種々の添加物を足したり引いたりして、無血清で骨格筋を培養できる培地を開発しました。

Mainak Das, John W. Rumsey, Neelima Bhargava, Cassie Gregory, Lisa Riedel, Jung Fong Kang and James J. Hickman
Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation
In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal Published online:09 May 2009

L15とM199を基本培地に、vitronectin、FGFなどを加えた培地を用いることにより、マウス胎児由来初代骨格筋細胞が、多核の筋繊維に分化させることが可能でした。

Medium Change Protocolによると、培養4日目まではbFGFを含んだ培地を用いますが、4日目にbFGFを全く含まない培地に全量交換します。その後、3日おきに培地の半分を交換しています。
それぞれの添加物の役割についてdiscussionで細かく説明されています。

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by koretoki | 2009-06-19 00:40
2009年 06月 17日

インフルエンザワクチンを昆虫セルラインで作ると

インフルエンザワクチンってまだ鶏卵で作ってるのかと思ってたら、そんなことなかったんですね。

June 12, 2009 07:15 CET
Novartis successfully demonstrates capabilities of cell-based technology for production of A(H1N1) vaccine


なんの細胞使ってるのかは知りませんが、ヘンリエッタさんの細胞の絞り汁とかだったらちょっと体に入れたくないですね・・・
宗教の理由で輸血を拒否される方は、ヒト細胞由来のワクチンはどうするんでしょう?
昆虫由来だったら・・・

Manon M.J. Cox and Jason R. Hollister
FluBlok, a next generation influenza vaccine manufactured in insect cells
Biologicals Volume 37, Issue 3, June 2009, Pages 182-189

著者等は、ヨトウガ由来細胞系SF+を用いてインフルエンザワクチンを作成する方法について安全性や効果を検討しました。

FluBlokという3価の血液凝集素ワクチン(rHA)はバキュロウィルス発現系を用いて作るワクチンであり、現在鶏卵を用いて作られている3価の不活性型インフルエンザワクチン(TIV)に対してアドバンテージを持つ可能性があります。高い安全性や、迅速なワクチン生産が期待されています。

まず、レトロウィルスが入ってないか調べました。IdUとか熱ショックとかかけて、ウィルス粒子が出てこないか電顕で調べました。結果、出てこなかったので→レトロウィルスがSF+に入ってないのが分かりました。
また、PCRで既知の昆虫ウィルスが入ってないかも調べました。

それから、治験を行いました。


rHAはTIVの3倍の凝集素を含み、オボアルブミンをはじめとした卵の蛋白や保存剤を含みません。また、純度の高い抗原は副作用の少ない多量投与を容易にするとも著者等は述べています。




以前に化学メーカーさんから、ウィルスフリーのセルラインない?って問い合わせがあったんですが、ワクチン作りたかったのかな?
治験は18歳以上の3000人の方の協力を得て行ったそうです。
謝礼を3万ちょい払うといちおくえん・・・
18才以下の子どもの治験って誰が意思決定するんでしょう?

そういえば先のノバルティスのワクチン、MF59®っていう加速装置みたいのを積んでるようです。
痛くて怖い予防接種もこういうこと考えながら行けばワクワクして楽しく受けられそうですね

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by koretoki | 2009-06-17 06:47