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2011年 05月 05日

昆虫のテロメラーゼ活性

だいぶ前に読んだけどメモしてなかったから探すの大変だった...
のでメモメモ。

Sasaki T, Fujiwara H.
Detection and distribution patterns of telomerase activity in insects.
Eur J Biochem. 2000 May;267(10):3025-31.

著者らは、テロメラーゼの昆虫での機能について調べるため、テロメア合成酵素の発現を昆虫の様々な組織、セルラインで調べました。

結果、
ゴキブリの脂肪体、神経、筋肉、精巣、germlineでは発現あり
カイコ、ショウジョウバエ、センチニクバエでは発現なし
でした。

つまり、
テロメラーゼは昆虫成虫の組織でふつうに発現してる
昆虫由来細胞系の無限増職能はテロメラーゼ活性と関係ない

もっとも、あいつらはトランスポゾンでテロメア伸ばしてることが分かってるのでなるほどなんですけど。

普段テロメラーゼなにしてるんでしょうね....



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by koretoki | 2011-05-05 01:18
2010年 11月 23日

昆虫ホルモンがカイコの後胚子発生において脂肪体の自然免疫を劇的に制御している

昆虫ホルモンによるゲノムワイドな自然免疫の制御@カイコ脂肪体

Ling Tian1†, Enen Guo2†, Yupu Diao1, Shun Zhou1, Qin Peng1, Yang Cao2, Erjun Ling1, Sheng Li1
Genome-wide regulation of innate immunity by juvenile hormone and 20-hydroxyecdysone in the Bombyx fat body
BMC Genomics 2010, 11:549

昆虫の自然免疫はJHと20Eに影響されうる。しかし、いかに自然免疫が2つのホルモンによって発生上制御されているかは解明されていない。カイコにおいては、最終脱皮(4M)の間にJHと20Eは高いレベルになり、5齢摂食時(5F)にはなくなる。一方蛹期では、JHは低く20Eは高いレベルになる。脂肪体はホルモン応答分子を生産し、ゆえに脂肪体は自然免疫に関与する主な器官とみなされてきた。

4M、5F、PPのカイコ脂肪体のゲノムワイドマイクロアレイ分析は多数の発現量の違う遺伝子を明らかにした。特に、4MではPPと比して、6つの抗菌ペプチド(AMP)が上方制御されている。このことは、カイコの自然免疫が発生上2つのホルモンによって制御されていることを示唆している。第一に、JH処理は劇的にAMP mRNAレベルと活性を増加させる。さらに、20E処理はAMP mRNAレベルと活性への阻害効果を示し、また、20Eレセプター EcR-USPをRNAiしたところ20E処理と逆の効果を示した。

カイコの後胚子発生における脂肪体では、JHは免疫活性剤として働き、20Eは自然免疫を阻害していた。

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by koretoki | 2010-11-23 02:09
2010年 11月 22日

ハエS2セルラインの細胞伸展についての全ゲノムRNAiスクリーニング

全ゲノムRNAiスクリーニング、なんて言葉がpubmedでふつうに引っかかってくるようになりました。
僕が大学入った頃と全然違う..

Michael V. D'Ambrosio and Ronald D. Vale
A whole genome RNAi screen of Drosophila S2 cell spreading performed using automated computational image analysis
The Journal of Cell Biology Published November 1, 2010 // JCB vol. 191 no. 3 471-478
http://jcb.rupress.org/content/191/3/471.long

細胞は様々な形態をとることがしられています。これまでも、細胞形態決定因子として、種々のタンパク質が同定され、またその機能が解析されてきました。アクチン細胞骨格は、もっとも研究された蛋白質のひとつで、他にも多くのタンパクの関与が示されています。RNAiによる遺伝子スクリーニングは細胞生物学的な活性を持つ蛋白質を同定する為の強力な方法ですが、これまで、細胞形態決定因子については限られた遺伝子しかRNAiの対象となっていませんでした(Kingerら994遺伝子、Rogersら96遺伝子)。それらの研究においては、手動の顕微鏡操作と、目視による分析が行われてきましたが、全ゲノムスクリーニングに求められる情報量は、目視で扱える量を超えてしまいます。昨今の顕微鏡関連技術の進歩によって、細胞ベースで全ゲノムをスクリーニングすることが可能になってきましたが、大量の画像データの取り扱いはいまだに容易ではなく、画像解析が全ゲノムスクリーニングを行う為の律速段階となって研究が進んでいません。著者らはこれを解決すべく、画像データの扱いを自動化することで、全ゲノムRNAiスクリーニングを成功させました。

本研究においては、ショウジョウバエ由来S2セルラインの細胞伸展に影響を与える遺伝子を見つける目的で、全ゲノムRNAiスクリーニングを行いました。Scar-Arp2/3 actin nucleation経路の遺伝子の関与が期待され、casein kinase Ⅰなどが同定されました。また、異なる非伸展型の形態的形質は、膜の分泌か合成に関わる遺伝子として同定されました。このグループに属する遺伝子として、新規の分泌ペプチドを同定し、2つの性質の分かっていなかった小胞体タンパク質が、分泌機能を持つことを明らかにしました。本研究を通して、既知の、あるいは予想されていなかったタンパク質が、細胞伸展において重要な役割を果たすことを示しました。

作戦のゴールは20-200くらいの遺伝子の"hit list"を作ること!full-genome Drosophila RNAi libraryのdsRNAを用いてS2細胞を5日間処理し、その後細胞をCon Aでコートした容器で3h培養し、固定してDNA, α-tubulin, actinを染色して観察しました。それらの顕微鏡画像を取り込み解析して、それぞれのRNAi実験区の細胞について以下の7つのパラメータを算出、評価しました。

FFT:Fast Fourier trans フーリエ変換で分けたときに出来た波の数=複雑さ
DT:Decision tree 決定木法でわけたときのクラスタ
NOC:No. of corners 細胞の輪郭の曲がりの回数
Actin perimeter intensity アクチン周囲長輝度
cell spreading Actin/area 細胞輪郭のうち、アクチンを発現している部分の割合
Decision tree arp/scar arp/scarを基準にクラスタ分けした場合
Dicision tree coffin/CAP coffin/CAPを基準にクラスタ分けした場合

それぞれのパラメータについて、Top40とBottom40の遺伝子リストができました。
リストは...長過ぎるので載せられないです...


放置しすぎて更新の仕方分からなくなってました....orz

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by koretoki | 2010-11-22 01:21
2010年 05月 19日

ネズミは生まれつきネコが嫌い

Fabio Papes, Darren W. Logan, Lisa Stowers
The Vomeronasal Organ Mediates Interspecies Defensive Behaviors through Detection of Protein Pheromone Homologs
Cell, Volume 141, Issue 4, 692-703, 14 May 2010

youtube上のプレゼンテーション

捕食者を忌避する行動はこれまでも観察されてきました。
マウスは捕食者(ネコ、ヘビ、ラット)の匂いに対して忌避行動を取り、ストレスホルモンを分泌します。著者らはこれらが遺伝的にプログラムされたものであると考え、嗅覚の重要性調べ、リガンドの同定、感覚ニューロンの同定を行いました。

vomeronasal organ(鋤鼻器)の機能を欠損したマウスでは捕食者の匂いに対する忌避行動が起こりませんでした。→鋤鼻器がリガンドを検出してる。
ラットの尿をフラクション分けしてマウスの忌避行動を元にバイオアッセイした結果、主要尿たんぱく質(major urinary protein)であるMup13がリガンドとして同定されました。また、Caイメージングすると、Mup13が鋤鼻器感覚ニューロンを発火させていることが分かりました。さらに、cFos染色によって、脳内の嗅覚中心が活性化していることも示しました。
リガンドは捕食者で共通するのか、という疑問に答えるため、ネコ由来のリガンドを同定し、同じmupファミリーであるFeld4を同定しました。マウスの感覚ニューロンがマウス、ラット、ネコのmupに対して別々に働き、捕食者には忌避を、同種には接触を誘導すると考えているようです。

捕食者じゃない動物、たとえば牛のmupはどういう扱いになるんでしょうかね?
あとは、匂いに関する遺伝的なプログラムと記憶との間の重み付けとかも面白そう
ネコと一緒に暮らしてるとネコには慣れるけどMHC近いのはずっと無理、とか



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by koretoki | 2010-05-19 10:22
2010年 05月 17日

こっちのみーずはあーまいぞー

degenerin/epithelial (Deg/ENaC) sodium channel familyであるPPK28が、水に対する細胞と行動の反応を仲介している。
Peter Cameron, Makoto Hiroi, John Ngai & Kristin Scott
The molecular basis for water taste in Drosophila
Nature 465, 91–95 (06 May 2010) doi:10.1038/nature09011

候補遺伝子は、味覚ニューロンをマイクロアレイして探索しました。哺乳動物の味覚システムではイオンチャンネルはすっぱさと塩味を検知していることから、著者らは、味覚リッチなイオンチャンネルを候補と考え解析を進めました。その中で挙がった遺伝子PKK28は、プロモータと推定される遺伝子で、口吻で発現していました。PKK28-Gal4のニューロンに様々な濃度のNaCl、Sucrose、Ribose、NMDG、PEG溶液を与え、G-CaMP系でニューロンの発火を検知したところ、いずれの溶液においても低濃度で発火しました。pkk28をノックアウトしたハエはスクロースに反応しましたが、水には反応できませんでした。苦味に反応する味覚ニューロンにpkk28を発現させると水に反応するようになりました。また、HEK293細胞にpkk28を発現させると低張液に反応するようになったそうです。

これらのことからPKK28を水の知覚に関連していると結論付けました。



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by koretoki | 2010-05-17 15:07
2010年 05月 15日

Freeの画像解析ソフトですよ

後輩に良いソフトを教えてもらったのです。
CellProfiler http://www.cellprofiler.org/

Carpenter AE, Jones TR, Lamprecht MR, Clarke C, Kang IH, Friman O, Guertin DA, Chang JH, Lindquist RA, Moffat J, Golland P, Sabatini DM.
CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.
Genome Biol. 2006;7(10):R100. Epub 2006 Oct 31.

CellProfilerを発表する論文です。使い方、たとえば、CellProfilerではいくつかのmodulesを組み合わせてpipelineをつくり、写真からデータを抽出しているのですが、そういうことが書いてあります。

実際の使用例として、細胞数測定、細胞サイズ測定、DNA量測定、リン酸蛋白量測定、蛋白局在解析、GFP標識物の動画解析、斑解析などがあげられています。
さらに具体的なテーマと組み合わせた例では、RNAiで起きた細胞の変形の度合いを調べたり、細胞質-核のトランスロケーションを調べたりしています。

当然フリーなので是非。
フリーといえば読みました。クリスアンダーソン著フリー
で、私が選ぶのはフリーミアムの恩恵を受けていこう、つまり、フリーの商材(研究資材)を活用して張富士夫の言うところの付加価値を提供していこうというやり方。CellProfilerの利用もその一環です☆



上と同様に紹介する論文。
Lamprecht MR, Sabatini DM, Carpenter AE.
CellProfiler: free, versatile software for automated biological image analysis.
Biotechniques. 2007 Jan;42(1):71-5.
今回は①プレート上で増えるイーストのコロニーを認識、コロニー数測定、コロニー大きさ測定②セルアレイの解析③GFPラベルしたマウス肺がんの解析、治癒中の傷の変化、ショウジョウバエの組織形態解析を例として挙げています。



CellProfiler Analyst、CellProfilerの横の置いてあるソフト
データの描出と機械学習が出来るそうです。
Jones TR, Kang IH, Wheeler DB, Lindquist RA, Papallo A, Sabatini DM, Golland P, Carpenter AE.
CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.
BMC Bioinformatics. 2008 Nov 15;9:482.

Jones TR, Carpenter AE, Lamprecht MR, Moffat J, Silver SJ, Grenier JK, Castoreno AB, Eggert US, Root DE, Golland P, Sabatini DM.
Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Feb 10;106(6):1826-31. Epub 2009 Feb 2.
機械学習はたとえば細胞の見分けなどに使われる技術で、教材となる画像をどんどんいれてやって、それに対する応答に正解不正解を付けてやる作業を繰り返すことで、ものの見分けを学習させようとするもので、論文中ではヒトの細胞について行っています。



CellProfilerを使って蛍光染色を減らそうとした論文
Selinummi J, Ruusuvuori P, Podolsky I, Ozinsky A, Gold E, Yli-Harja O, Aderem A, Shmulevich I.
Bright field microscopy as an alternative to whole cell fluorescence in automated analysis of macrophage images.
PLoS One. 2009 Oct 22;4(10):e7497.
これまで細胞を画像認識しようとするときに、核と細胞質全体をそれぞれ別の蛍光で染色し、見分けていました。著者らは、細胞質全体の染色による認識を、明視野顕微鏡(もっとも基本的な顕微鏡)からの画像情報を処理して認識しやすくしたもので、置き換えようと考えました。実際には明視野の画像をストックし、コントラストを極端に強調したものを重ね合わせることで可能にしているようです。



プログラミングのスキルのない生物学者が多型分析とかをするためのツール
Misselwitz B, Strittmatter G, Periaswamy B, Schlumberger MC, Rout S, Horvath P, Kozak K, Hardt WD.
Enhanced CellClassifier: a multi-class classification tool for microscopy images.
BMC Bioinformatics. 2010 Jan 14;11:30.
CellProfilerが出したデータを利用者が簡単に解析できることを目的としたソフトのようです。論文中の例では、
①hepatocyte growth factor(HGF)が細胞のラフリングに与える影響を調べています。HGFをHeLaに与え、ラフリングさせた画像を解析しようとしたところ、上手くいきませんでした。というのも、ラフリングした細胞/ラフリングしない細胞だけでなく、有糸分裂中の細胞もあったからです。そこで、CellClassifierを用い782枚の画像を元に機械学習を行い、それらの見分けを可能にしたことでラフリングの解析を行いました。
②サルモネラ菌がHeLaにくっつくのを調べています。結果として、40%の細胞にサルモネラ菌が付着している条件化で、90%の有糸分裂中の細胞に付着が、また、40%弱の通常の細胞に付着が見られました。



最後に技術系でない論文を
Hoffman EM, Miller KE.
Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan-induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat.
Neurosci Lett. 2010 Mar 26;472(3):157-60. Epub 2010 Feb 2.
まず、
Hoffman EM, Miller KE.
まず、カラゲナン上の末梢神経へのGLS阻害が誘導する後ろ足の膨潤の影響を調べました。足底へカラゲナンを注入し、後ろ足だけ膨潤することを示しました。次に、カラゲナン上の末梢神経へのGLS阻害が誘導するFos発現の影響を調べました。Fosを免染し、Fosを発現している核の数を数えました。この測定にCellProfilerを使っています。1報目の論文で、”modules”を組み合わせて"pipeline"をつくる、と書きましたが、この論文ではそのpipelineがtableの形で載っています。さて、この研究では、グルタミナーゼの末梢神経阻害がカラゲナンに誘導されるFos発現を減少させる、とのことですが、よくわかりません。どうも、カラゲナンは炎症を誘導するための剤のようで、Fosが末梢の炎症の指標のようです。グルタミナーゼは神経のミトコンドリアにあってグルタミンを加水分解する酵素であるので、炎症情報の生体内伝達が液性因子だけでなく神経に仲介された情報伝達によって行われることを示唆しているのではないでしょうか。abstには、グルタミナーゼが炎症を沈める治療の新しい標的になりうると書いてあります。




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by koretoki | 2010-05-15 12:31
2010年 05月 15日

培地データベース

Brunner D, Frank J, Appl H, Schöffl H, Pfaller W, Gstraunthaler G.
Serum-free cell culture: the serum-free media interactive online database.
ALTEX. 2010;27(1):53-62.

http://www.goodcellculture.com/

FBSを使わない培養にはいろいろメリットがあるけど、細胞にあったFBSフリーの培地を探すのは手間なもの。interactive online databaseつくって情報交換しようよ、っていうことらしいです。この論文自体は培養とは何か、とか、FBSの役割、とか易しい総説風です。後輩にあげよう。

さっそくgoodcellcultureでぐぐってみたものの、topしか表示されない・・・
IEでやり直し。Gchromeでは駄目でした。

現時点で登録されている昆虫細胞用の培地は以下の16です。

BD BaculoGold Max-XP, BIOINSECT-1, CELLect Insect Cell Culture Medium, CELLect Serum-free Insect Virus, Chemically Defined Lipid Concentrate, Drosophila-SFM, Express Five SFM, HyClone SFX-Insec Cell Culture, Insect Express Prime, Insect Medium Supplement, IS BAC Medium for Insect Cells, Serum Free, Met Free Insect Culture Medium, Serum-Free Insect Culture Medium, Serum-free Insect Medium-1 Protein-free, Sf-900 II SFM, Sf-900 III SFM

初代培養をやるときの培地選びって、前例がなければ端から順番にやるしかない。そういうときに近い動物での成功例が分かったらとても助かると思います。




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by koretoki | 2010-05-15 05:11
2010年 05月 15日

放射線おいしいです

Dadachova E, Bryan RA, Huang X, Moadel T, Schweitzer AD, Aisen P, Nosanchuk JD, Casadevall A.
Ionizing radiation changes the electronic properties of melanin and enhances the growth of melanized fungi.
PLoS One. 2007 May 23;2(5):e457.

チェルノブイリで放射線を食べる菌が見つかるとのことで、PLoS ONEを読んでみました。

メラニン色素は様々な環境負荷に耐える能力を生物に与えてきました。一方で、生物の色素は光エネルギーを電子エネルギーへと変換し、光合成の重要な役割を担っています。メラニン色素が可視光とUVを吸収できることから、著者らは電離放射線(電子、陽子、x線、中性子など)がメラニンの電子状態を変え、そしてメラニン化した微生物の発育を促進しているのではないかと考えました。

まず、3種の菌がもつメラニンをHPLCで解析しました。C.neoformansはTDCA, PTCAを、C.sphaerospermumはPDCA, PTCAを、W.dermatitidisはTDCA, PTCAを、それぞれ持っていました。それらのメラニンの電子スピンをESR(電子スピン共鳴法)で調べ、フリーラジカルがあること、また、電離放射線照射によってESR信号に大きな変化が出ることを示しました。

それから、メラニンの電子供与体としての性質を、NADHの酸化とフェリシアン化物の減少を指標として調べることにしました。実際に、電離放射線照射によって、C.neoformans由来のメラニンの電子供与体としての効果は14Gy/min 20分の暴露で3倍に、14Gy/min 40分の暴露によって4倍になっています。

電離放射線照射と菌の生育の相関を見た実験では、0.05mGy/hr照射によって菌の生育が2.5倍に上がったそうです。



いまひとつ腑に落ちないのが、NADH/フェリシアン化物の方法でメラニンの電子供与体としての性質を調べたときに14Gy/minの照射を行ったのに対して生育を見ようとする実験で0.05mGy/hrの照射で行っている点。メラニンが電離放射線のエネルギーを化学エネルギーに変換できるというのはとてもよく分かるのですが、ほんとにそれ食べられてるんでしょうか?0.05mGy/hrの照射でNADH/フェリシアン化物試験を行ったらどうなるんでしょう?1Gy以上被爆するとヒトが具合悪くなるらしいので(wikipedia)、0.05mGy/hrってもの凄く少ないですね。これって放射線ホルミシス?放射線ホルミシス効果検証プロジェクト


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by koretoki | 2010-05-15 04:33
2010年 04月 26日

精子競争≒自転車競技

Heidi S. Fisher & Hopi E. Hoekstra
Competition drives cooperation among closely related sperm of deer mice
Vol 463| 11 February 2010| doi:10.1038/nature08736


e0160319_19392423.jpg


メス体内での精子競争で、同個体由来の精子たちはチームを組んで走り抜けるらしい。
最後はチームを解散して競争。
これなんてtour de vagina
写真はチームを組んでいる精子

ナショナルジオグラフィック ニュース精子は “兄弟”認識、群れで卵子目指す

半年くらい放置してしまいました申し訳ありません
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by koretoki | 2010-04-26 19:40
2009年 12月 02日

蛍光灯による化学的コンタミネーション

先日「シグマ細胞培養マニュアル」なるものをいただきました。
マニュアルと言ってもシグマの試薬のカタログなので、特に何の期待も持たずにぱらぱらとめくっていたのですが、技術情報のところが意外と面白い…

John Ryan
細胞培養における汚染物質の理解
シグマ細胞培養マニュアル 第3版 293-304

特に化学的コンタミネーションの項に”蛍光灯”が入っていてびっくりしました。なんでも、リボフラビンやトリプトファンが含有する培地を蛍光灯に暴露すると、過酸化水素やフリーラジカルが生成されると言うのです。以前から可能性は疑っていたので長期保存するときは遮光して置いたのですが、ちゃんとこういう研究もあったのですね。インキュベータの中に置いてある培地にも慌ててアルミホイルを巻きました。in vitroがin vitroであることを忘れてしまっていたようで、反省しています。

参考文献に挙げられていました↓
Wang RJ.
Effect of room fluorescent light on the deterioration of tissue culture medium.
In Vitro. 1976 Jan;12(1):19-22.


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by koretoki | 2009-12-02 15:19