したっぱ昆虫細胞研究者のメモ

はじめまして!

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お家でできるMac Bookでやる次世代シーケンスデータ解析

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オートファジーがアポトーシスを防ぐ

２つの鱗翅目のセルラインの飢餓への対応から、オートファジーの仕事をみた論文

Wu W, Wei W, Ablimit M, Ma Y, Fu T, Liu K, Peng J, Li Y, Hong H.
Responses of two insect cell lines to starvation: Autophagy prevents
them from undergoing apoptosis and necrosis, respectively.
J Insect Physiol. 2011 Jun;57(6):723-34. Epub 2011 Feb 16.

著者らは、セルラインをIBSS(Insect balanced salt solution: 75mM
Nacl, 5mM CaCl2, 55mM KCl, 2.6mM MgCl2・6H2O, 2.8 mM MgSO4・7H2O, 4.2 mM
NaHCO3, 7.3mM NaH2PO4・H2O, 10 mM glucose, pH 6.4)に移し、飢餓状態にして実験しました。

SL-ZSL-1をIBSSに入れるとのオートファジーを誘導されました。長い飢餓でアポトーシスが誘導され、apoptotic bodyの形成やcaspase-3-likeの活性上昇など、48h以上の飢餓で引き起こされます。飢餓の早い段階で3-MAを添加してオートファジーを防ぐとアポトーシスすることがわかり、このことからオートファジーがアポトーシスを阻害しているのではないかとかんがえました。

一方、Bm36は48h以上の飢餓においてもアポトーシスはしませんが壊死に近い死を迎えます。Actinomycin Dの添加によってアポトーシスを引き起こせるので、Bm36はアポトーシスの機能は保持しています。また、48hの飢餓でも死なないBm36は、飢餓の早い段階での3-MA添加によるオートファジーの阻害によってアポトーシスを誘導せずにに壊死します。

２つのセルラインのAcid phosphataseについて分析すると、SL-ZSL-1の方がBm36よりもオートファジー活性が強いことがわかりました。また、caspase-likeの活性も高く飢餓に誘導されます。

オートファジーはアポトーシスを防いでいるが、長期の飢餓により昆虫細胞は死に至る。
そしてその死の経路には、caspase-9-like, saposin-like, Atg6が必要そうだ。




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D.m.由来セルラインの発現比較

キイロショウジョウバエのセルラインは生物学的な資源として貴重な存在です。それらが、どのような遺伝子を発現しているのか、著者らはマイクロアレイと次世代シーケンサーを用いて調査しました。

Lucy Cherbas, Aarron Willingham, Dayu Zhang, et al.
The transcriptional diversity of 25 Drosophila cell lines
Genome Res. 2011 Feb;21(2):301-14. Epub 2010 Dec 22.

25のセルラインについてしらべた、結果、発現しているものが以下の様であるとしています。
・64%の遺伝子は少なくとも一つのセルラインで発現していたが、21%の遺伝子だけが全てのセルラインで発現していた。
・それぞれのセルラインは平均5885の遺伝子を発現していて、3109個は共通していた。
・ほとんどのdifferentiation pathwayはoffであり、いくつかのdifferentiation pathwayとgrowth pathwayがonであった。
・それぞれのセルラインで発現しているだいたい50%の遺伝子は一般的なセットではなく、それらが個性を示しているかもしれない。
・31%の遺伝子は少なくとも一つのセルラインで発生上のどのステージより高い発現を示しており、このことは、それぞれのセルラインが細胞の小さいセットの遺伝子の特性に富んでいる事を示唆する。

さらに、成虫盤由来のセルラインについて、それぞれのセルラインが由来する成虫盤上の部位のマーカーとなる遺伝子を発現しているかを調べたところ、セルラインの発現パターンは、由来である発生中の成虫盤の小さな範囲の遺伝子発現パターンと一致していることが明らかになりました。転写因子独自に発現しているセルラインは見つからず、これらの結果から、それぞれのセルラインは始祖の細胞の特徴を維持しながら、一般的な"cell line"の遺伝子発現パターンを合わせ持っていると結論づけました。


Entdifferenzierungは無いということか…
そうかなぁ


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次世代解析の特に比較に便利なRパッケージ: DEseq

次世代シーケンスデータの解析には、配列情報を扱うものと、それに引き続く数値（発現量とか）を扱う段階がありますが、後者の方はまだあんまり王道がないです（と思ってます）。

mRNA-seqの発現比較方法として、Z検定を用いたもの、GLMを用いたものなんかがありますが、パッケージになってないと使い方分からないし、正規化の方法も何やってんだかわからないです。

Rのパッケージで使ってみて良さそうなのがあったのでメモメモ

Simon Anders* and Wolfgang Huber
Differential expression analysis for sequence count data
Genome Biology 2010, 11:R106

いつもお世話になってる門田先生のHP(Rで)塩基配列解析（主に次世代シーケンサーのデータ） by 門田幸二でDEGseqっていうパッケージとDEseqっていうパッケージが紹介されていたので試しに使ってみました。

データ次第でしょうが、僕の手元のデータではDEGseqを使うとFDRが小さいものが大量に出てきてしまいました。発現変動遺伝子が多すぎて溺れそうです。一方、DEseqではFDRが小さいものが”ぼちぼち”出てきました。いい感じです。しかも計算が早い。途中、

sizeFactors(cds)

をして計算された正規化係数をみると、TMM正規化で出てきた正規化係数と近い値が出てきていました。TMM正規化では、そもそも細胞／組織中のtotalRNAの量なんて違うんじゃないの？発現の大きな一部の遺伝子にほとんどひっぱられてんじゃないの？という仮定に基づいていて、個人的に説得力があって好きです。

感動したのはこの一節。
"DESeq allows analysis of experiments with no biological replicates in one or even both of the conditions. While one may not want to draw strong conclusions from such an analysis, it may still be useful for exploration and hypothesis generation."
かゆいところに手が届きそうですw

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